マウス骨格筋移植からの原発性筋芽生の単離と分化
Summary
ミオブラストは、多核化ミオチューブと最終的に骨格筋筋筋筋繊維を形成するために分化する前駆細胞を増殖させる。ここでは、若年成人マウス骨格筋からの原発筋芽生の効率的な単離および培養のためのプロトコルを提示する。この方法は、培養中の筋肉細胞の分子的、遺伝的、代謝的研究を可能にする。
Abstract
原発性筋芽生児は、骨格筋の未分化増殖前駆体である。彼らは培養し、筋肉の前駆体として研究したり、筋肉の発達の後の段階に区別するように誘導することができます.ここで提供されるプロトコルは、若い成人マウス骨格筋移植から筋芽細胞の高増殖集団の単離および培養のための堅牢な方法を説明する。これらの細胞は、異なるマウスモデルの骨格筋の代謝特性の研究、ならびに外因性DNAによるトランスフェクションやウイルス発現ベクターによるトランスダクションなどの他の下流アプリケーションの研究に有用である。これらの細胞の分化および代謝プロファイルのレベルは、暴露の長さ、および筋芽細胞分化を誘導するために使用される培養物の組成に依存する。これらの方法は、マウス筋細胞代謝ex vivoの研究のための堅牢なシステムを提供する。重要なのは、生体内モデルとは異なり、ここで説明する方法は、高いレベルの再現性で拡張および研究できる細胞集団を提供する。
Introduction
多くの場合、全体的な代謝健康の指標として引用されているが、複数の研究は、高齢者のボディマス指数(BMI)が一貫して死亡率の高いリスクと関連付けられていないことを示しています。現在までに、この集団における死亡率の低下と一致することが示された唯一の因子は、筋肉量1の増加である。筋肉組織は、体内のインスリン感受性細胞の最大の供給源の1つを表し、したがって、全体的な代謝恒常性2の維持に重要である。運動による骨格筋組織の活性化は、局所インスリン感受性と全体的な代謝健康3の両方の増加に関連している。生体内モデルでは、筋肉の生理学と統合された代謝に対する筋肉機能の影響を研究するために不可欠であるが、ミオチューブの一次培養は、動物研究の複雑さを軽減する扱いやすいシステムを提供する。
出生後の筋肉に由来する筋芽生性は、非常に再現性の高い方法で多数の治療と成長条件の影響を研究するために使用することができます。これは長い間認識されており、筋芽生性分離および培養のためのいくつかの方法が説明されています4,5,6,7, 8,9.これらの方法のいくつかは、新生児の筋肉を使用し、ミオブラスト5、8の比較的低い数を生み出し、より大規模な研究のためにいくつかの動物を必要とします。また、筋芽細胞を培養するための最も広く使用されている方法は、他の細胞型よりも付着性が低い筋芽細胞を濃縮するために「プレメッキ」を使用します。我々は、ここで説明する代替濃縮方法は、非常に増殖性の高い筋芽生性集団を濃縮するためにはるかに効率的で再現性があることを見出した。要約すると、このプロトコルは、培養培地への成長を介して、若い成人筋移植から非常に増殖性の筋芽生性の単離を可能にする。ミオブラストは、数日間にわたって繰り返し収穫することができ、急速に拡大し、ミオチューブに分化するように誘導される。このプロトコルは、自発的にけいれんミオチューブに強く分化する多数の健康な筋芽細胞を再現的に生成します。様々なマウスの一次筋管における代謝と概日リズムを研究することが可能になりました。最後に、96ウェルプレートの酸素消費率の測定値を用いて、酸化代謝の研究のために筋管を調製する方法を取り入れています。
Protocol
Representative Results
Discussion
骨格筋は、代謝恒常性11の確立と維持のために不可欠である。筋肉生理学の研究は、特に人間の研究の場合には、個々の変動、ならびにサンプルを得ることの困難によって複雑である。培養された原発性筋管は、カルシウム恒常性12、損傷した筋肉組織5の再生、運動13に応答する代謝変化を含む筋肉生理学の多くの特徴を…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、メルボルン大学のマシュー・ワット博士とジョンズ・ホプキンス大学のアナスタシア・クラリ博士に感謝し、Mokbelらの研究に基づいてこのプロトコルを採用する支援を行っています6.また、サビーヌ・ヨルダン博士が当研究室でこのプロトコルを開発し、採用する支援をしてくれたことに感謝します。この研究は、国立衛生研究所R01s DK097164とK.A.L.へのDK112927によって資金提供されました。
Materials
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
References
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