Isolatie en karakterisering van patiënt-afgeleide pancreatic Ductal adenocarcinoom Organoid modellen
Summary
Patiënt-afgeleide organoïde culturen van pancreas ductaal adenocarcinoom zijn een snel gevestigde 3-dimensionale model dat epitheliale tumor cel compartimenten met hoge getrouwheid vertegenwoordigen, waardoor translationeel onderzoek naar deze dodelijke maligniteit. Hier bieden we gedetailleerde methoden om organoïden te vestigen en door te geven en om relevante biologische testen uit te voeren met behulp van deze modellen.
Abstract
Pancreas adenocarcinoom (PDAC) behoort tot de meest dodelijke maligniteiten. Onlangs zijn de volgende-generatie organoïde cultuur methoden die de 3-dimensionale (3D) modellering van deze ziekte mogelijk maken beschreven. Patiënt-afgeleide organoïde (Bob) modellen kunnen worden geïsoleerd van zowel chirurgische specimens als kleine biopsieën en vormen snel in de cultuur. Belangrijker is dat organoïde modellen de pathogene genetische veranderingen in de tumor van de patiënt behouden en voorspellend zijn voor de behandelings respons van de patiënt, waardoor translationele studies mogelijk zijn. Hier bieden we uitgebreide protocollen voor het aanpassen van weefselcultuur workflow om 3D, matrix Embedded, organoïde modellen te bestuderen. We geven gedetailleerde methoden en overwegingen voor het isoleren en doorgeven van primaire PDAC organoïden. Verder beschrijven we hoe op maat gemaakte organoïde-media worden bereid en kwaliteitscontrole in het laboratorium. Ten slotte beschrijven we assays voor downstreamkarakterisatie van de organoïde modellen zoals isolatie van nucleïnezuren (DNA en RNA), en drug testen. Belangrijk is dat we kritische overwegingen voor de implementatie van organoïde methodologie in een onderzoek laboratorium.
Introduction
Het pancreas adenocarcinoom (PDAC) is een dodelijke aandoening die wordt gekenmerkt door een late diagnose bij de meeste patiënten, een gebrek aan effectieve therapieën en een resulterende lage totale overlevingskans van 5 jaar die minder dan 10%1blijft. Slechts 20% van de patiënten wordt gediagnosticeerd met een gelokaliseerde ziekte die geschikt is voor curatieve chirurgische ingrepen2,3. De resterende patiënten worden doorgaans behandeld met een combinatie van chemotherapeutische middelen die werkzaam zijn bij een minderheid van de patiënten4,5. Om deze dringende klinische behoeften aan te pakken, zijn onderzoekers actief bezig met vroegtijdige detectie strategieën en de ontwikkeling van effectievere therapieën. Om de klinische vertaling van belangrijke ontdekkingen te versnellen, maken wetenschappers gebruik van genetisch gemanipuleerde muismodellen, patiënt afgeleide xenografts, monolaag cellijnen, en, meest recentelijk, organoïde modellen6.
Driedimensionale epitheliale organoïde cultuur met behulp van groeifactor en WNT-ligand rijke voorwaarden ter stimulering van de proliferatie van niet-getransformeerde voorlopercellen werden voor het eerst beschreven voor de muis darm7 en werden snel aangepast aan de normale menselijke alvleesklier weefsel8. Naast normale ductale weefsel, organoïde methodologie maakt het mogelijk voor de isolatie, uitbreiding, en studie van de menselijke PDAC8. Belangrijk is dat de methode de oprichting van organoïden uit chirurgische specimens ondersteunt, evenals fijne en kern naald biopsieën, waardoor onderzoekers alle stadia van de ziekte9,10kunnen bestuderen. Belangwekkend, patiënt-afgeleide organoïden even goed beschreven tumor Transcriptomic subtypen en kan ontwikkeling van precisie geneeskunde platformen9,11.
De huidige organoïde protocollen voor PDAC maken de succesvolle expansie van meer dan 70% van de patiënt monsters van chemo-naïeve patiënten9mogelijk. Hier presenteren we de standaardmethoden die door ons laboratorium worden gebruikt om patiënt afgeleide PDAC-organoïden te isoleren, uit te breiden en te karakteriseren. Andere organoïde methodologieën van PDAC zijn12,13 beschreven, maar geen vergelijking van deze methode is grondig uitgevoerd. Omdat deze technologie relatief nieuw is en snel vordert, verwachten we dat deze protocollen zullen blijven evolueren en verbeteren; de principes van weefselbehandeling en organoïde cultuur zullen echter nuttig blijven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we de huidige protocollen voor het isoleren, uitbreiden en karakteriseren van patiënten afgeleide PDAC organoïden. Ons huidige succespercentage van het oprichten van organoïde cultuur is meer dan 70%; Daarom, deze methoden zijn nog niet geperfectioneerd en worden verwacht te verbeteren en evolueren in de tijd. Er moet belangrijke aandacht worden geschonken aan de steekproefgrootte, aangezien PDAC een lage neoplastische cellulariteit heeft. Dientengevolge, kleine specimens zal bevatten weinig tumorcell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor de steun van de UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository en weefsel technologie gedeelde bron, leden van de Lowy laboratorium, en de UC San Diego Department of Surgery, afdeling Chirurgische oncologie. AML wordt royaal ondersteund door NIH CA155620, een SU2C CRUK Lustgarten Foundation pancreatic cancer Dream Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16), en donoren van het Fonds om pancreaskanker te genezen.
Materials
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary. Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).
- Winter, J. M., et al. 1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).
- Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).
- Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. Modeling pancreatic cancer with organoids. Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Tiriac, H., et al. Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Tiriac, H., et al. Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment. Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).
- Seino, T., et al. Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
- Zhao, C. Wnt Reporter Activity Assay. Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer. New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).
- Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
