בידוד ואפיון של החולה-הלבלב הנגזר דוטל אדנוקרצינומה מודלים אורגאיד
Summary
המטופל-התרבויות הנגזרות של הלבלב אדנוקרצינומה הם מודל תלת מימדי מבוסס במהירות המייצגים תאים סרטניים אפיתל הגידול עם נאמנות גבוהה, המאפשר מחקר טרנסלtional לתוך זה ממאירות קטלני. כאן, אנו מספקים שיטות מפורטות כדי ליצור ולהפיץ אורגנואידים, כמו גם לבצע מאמר ביולוגי רלוונטי באמצעות מודלים אלה.
Abstract
לבלב הלבלב אדנוקרצינומה (PDAC) הוא בין ממאירות קטלנית ביותר. לאחרונה, הדור הבא שיטות תרבות אורגאיד המאפשרות מידול תלת מימדי (3D) של מחלה זו תוארה. מודלים מסוג אורגאיד הנגזר מהמטופל (PDO) יכולים להיות מבודדים הן מדגימות הניתוח והן מהביופסיה הקטנה והצורה במהירות בתרבות. חשוב מכך, מודלים אורגנואיד לשמר את השינויים הגנטיים הפתוגניים שזוהו בגידול של המטופל, הם ניבוי של תגובת הטיפול של המטופל, ובכך מאפשר מחקרים טרנסלבותית. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מקיפים להתאמת זרימת העבודה של תרבות רקמות כדי ללמוד 3D, מטריקס מוטבע, מודלים אורגנואיד. אנו מפרטים שיטות ושיקולים עבור בידוד והפצת הראשי PDAC אורגנואידים. יתר על כן, אנו מתארים כיצד מדיה אורגאיד העידו מוכן איכות בשליטה במעבדה. לבסוף, אנו מתארים בחני האפיון המטה של מודלים אורגנואיד כגון בידוד של חומצות גרעין (DNA ו-RNA), ובדיקות סמים. חשוב לציין שיקולים קריטיים ליישום מתודולוגיה ארגונית במעבדת מחקר.
Introduction
מחלת הלבלב אדנוקרצינומה (PDAC) היא מחלה קטלנית המאופיינת אבחנה מאוחרת ברוב החולים, חוסר טיפולים יעילים, ושיעור כתוצאה נמוכה 5-שנה הישרדות הכוללת שנשאר פחות מ 10%1. רק 20% מהחולים מאובחנים עם מחלה מקומית מתאים התערבות כירורגית מרפא2,3. המטופלים הנותרים מטופלים בדרך כלל עם שילוב של סוכני כימותרפיה כי הם יעילים במיעוט של חולים4,5. כדי לענות על הצרכים הקליניים הדחופים האלה, חוקרים עובדים באופן פעיל על אסטרטגיות גילוי מוקדם ופיתוח של טיפולים יעילים יותר. כדי להאיץ את התרגום הקליני של תגליות חשובות, מדענים מהונדסים גנטית מודלים העכבר, החולה נגזר xenografts תלי, מונאולייר תאים קווים, ו, לאחרונה, מודלים אורגאיד6.
תרבות תלת ממדית האפיתל אורגאיד באמצעות גורם הצמיחה ו-Wnt-ligand התנאים עשיר כדי לעורר התפשטות של תאים מחולל שינוי לראשונה תוארו על מעיים העכבר7 והותאמו במהירות לרקמת הלבלב האנושי נורמלי8. בנוסף רקמת דוטל רגילה, מתודולוגיה ארגונית מאפשרת בידוד, התרחבות, ולימוד של האדם PDAC8. חשוב לעשות זאת, השיטה תומכת בהקמת אורגנואידים מדגימות כירורגי, כמו גם ביופסיות מחט בסדר הליבה, המאפשר לחוקרים ללמוד את כל שלבי המחלה9,10. מעניין, מטופל נגזר החולה לכידה היטב מתוארים הגידול תת-ממדי והוא עשוי לאפשר פיתוח של פלטפורמות רפואה מדויקת9,11.
הפרוטוקולים הנוכחיים של הארגון עבור PDAC מאפשרים הרחבה מוצלחת של יותר מ-70% מדגימות המטופלים ממטופלים תמימים מכימותרפיה9. כאן אנו מציגים את האמצעים הסטנדרטיים המועסקים על ידי המעבדה שלנו כדי לבודד, להרחיב, ולאפיין את החולה הנגזרות PDAC אורגנואידים. מתודולוגיות משנה נוספות של pdac מתוארות12,13 אך לא השוואה של שיטה זו בוצעה ביסודיות. כאשר טכנולוגיה זו היא חדשה יחסית ומתקדמת מהר, אנו מצפים כי פרוטוקולים אלה ימשיכו להתפתח ולשפר; עם זאת, העקרונות של הטיפול ברקמה ותרבות אורגאידית ימשיכו להיות שימושיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים הנוכחיים לבידוד, הרחבה ואפיון של מטופלים שמקורם בארגון PDAC. שיעור ההצלחה הנוכחי שלנו של הקמת תרבות ארגונית הוא מעל 70%; לכן, שיטות אלה עדיין לא שלמות וצפויים לשפר ולהתפתח עם הזמן. יש להתחשב בגודל המדגם, בדומה ל-PDAC בעל cellularity-הנאופלסטית נמוכה. כתוצאה מכך, דגימות קט?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה על תמיכתם של מרכז הסרטן בסן דייגו מורס ביווריפוזיטורי וטכנולוגיית רקמה משותפת, חברי המעבדה Lowy, ואת המחלקה לכירורגיה בסן דייגו של ה-UC, חטיבה של אונקולוגיה כירורגית. AML נתמך בנדיבות על ידי NIH CA155620, SU2C CRUK קרן Lustgarten בסיס לסרטן הלבלב החלום פרס הקבוצה (SU2C-AACR-DT-20-16), ותורמים לקרן לרפא סרטן הלבלב.
Materials
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Khorana, A. A., Mangu, P. B., Katz, M. H. G. Potentially Curable Pancreatic Cancer: American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline Update Summary. Journal of Oncology Practice. 13 (6), 388-391 (2017).
- Winter, J. M., et al. 1423 pancreaticoduodenectomies for pancreatic cancer: A single-institution experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 10 (9), 1210-1211 (2006).
- Von Hoff, D. D., et al. Increased survival in pancreatic cancer with nab-paclitaxel plus gemcitabine. New England Journal of Medicine. 369 (18), 1691-1703 (2013).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer. New England Journal of Medicine. 364 (19), 1817-1825 (2011).
- Baker, L. A., Tiriac, H., Clevers, H., Tuveson, D. A. Modeling pancreatic cancer with organoids. Trends in Cancer. 2 (4), 176-190 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Tiriac, H., et al. Organoid Profiling Identifies Common Responders to Chemotherapy in Pancreatic Cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
- Tiriac, H., et al. Successful creation of pancreatic cancer organoids by means of EUS-guided fine-needle biopsy sampling for personalized cancer treatment. Gastrointestinal Endoscopy. , (2018).
- Seino, T., et al. Human Pancreatic Tumor Organoids Reveal Loss of Stem Cell Niche Factor Dependence during Disease Progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Walsh, A. J., Castellanos, J. A., Nagathihalli, N. S., Merchant, N. B., Skala, M. C. Optical Imaging of Drug-Induced Metabolism Changes in Murine and Human Pancreatic Cancer Organoids Reveals Heterogeneous Drug Response. Pancreas. 45 (6), 863-869 (2016).
- Zhao, C. Wnt Reporter Activity Assay. Bio-Protocol. 4 (14), 1183 (2014).
- Conroy, T., et al. FOLFIRINOX or Gemcitabine as Adjuvant Therapy for Pancreatic Cancer. New England Journal of Medicine. 379 (25), 2395-2406 (2018).
- Jimeno, A., et al. A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (2), 310-314 (2009).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
