تصميم دعامة الرغامي المضادة للادويه المتوافقة بيولوجيا في الفئران مع تضيق الحنجرة
Summary
ينتج تضيق الحنجرة من ترسب الندبة الباثولوجي الذي يضيق بشكل خطير مجري القصبات الهوائية ويفتقر إلى العلاجات الطبية الفعالة. باستخدام PLLA-PCL (70 ٪ بولي-L-lactide و 30 ٪ polycaprolactone) الدعامات كنظام تسليم المخدرات المحلية ، يمكن دراسة العلاجات المحتملة التي تهدف إلى خفض انتشار ندبه في القصبة الهوائية.
Abstract
تضيق الحنجرة (لتر) هو تضييق باثولوجي للتهاب الرغامي والقصبة الهوائية مما يؤدي إلى انسداد خارج المضيق وضيق كبير في التنفس. ينتج هذا المرض عن أصابه الغشاء المخاطي من جسم غريب في القصبة الهوائية ، مما يؤدي إلى تلف الانسجه والاستجابة التهابيه المحلية التي تذهب بشكل منحرف ، مما يؤدي إلى ترسب الانسجه المصابة بندبات مرضيه. العلاج لل ه هو الجراحية بسبب عدم وجود العلاجات الطبية الفعالة. والغرض من هذا الأسلوب هو بناء الدعامات المتوافقة مع الحيوية التي يمكن تصغيرها لوضعها في الفئران مع لتر. أظهرنا ان PLLA-PCL (70 ٪ بولي-L-lactide و 30 ٪ polycaprolactone) بناء كان الأمثل نشاط القوه ، كانت متوافقة بيولوجيا ، عمليا في وضع الدعامات في الجسم الحيوي ، وقادره علي التملص من المخدرات. يوفر هذا الأسلوب نظام تسليم المخدرات لاختبار العوامل المناعية المختلفة لمنع التهاب محليا والحد من تليف مجري التنفس. تصنيع الدعامات ياخذ 28 − 30 ح ويمكن استنساخها بسهوله ، مما يسمح للتجارب مع الأفواج الكبيرة. هنا أدرجنا راباميسين المخدرات داخل الدعامة لاختبار فعاليتها في الحد من التليف وترسب الكولاجين. وكشفت النتائج ان الخيام plla-PCL أظهرت الإفراج عن راباميسين موثوق بها ، وكانت مستقره ميكانيكيا في الظروف الفسيولوجية ، وكانت متوافقة بيولوجيا ، مما يحفز استجابه التهابيه قليلا في القصبة الهوائية. وعلاوة علي ذلك ، فان الدعامات PLLA-PCL التي تقلل من الندبات في القصبة الهوائية في الجسم المجري.
Introduction
تضيق القصبة الهوائية هو تضييق باثولوجي للرغامي في معظم الأحيان بسبب الاصابه بعد التنبيب الضموري. الجمع بين الاستعمار البكتيري ، استجابه الجسم الاجنبيه لفغر الرغامي أو أنبوب الرغامي ، والعوامل الخاصة بالمريض تؤدي إلى استجابه التهابيه شاذة. يؤدي هذا الاستجابة المناعية غير المتكيفة إلى ترسب الكولاجين في القصبة الهوائية ، مما يؤدي إلى تضييق القصبة الهوائية والتضيق اللاحق1،2. ونظرا لان العلاج الحالي لهذا المرض هو في المقام الأول الجراحية ، وتطوير بديل العلاج الطبي القائم علي نموذج استهداف مسارات التهابيه والخبيثة المنحرفة التي تؤدي إلى ترسب الكولاجين المفرط قد درست. راتاميسين ، الذي يمنع مركب الإشارات mTOR ، وقد ثبت ان لها تاثيرات المناعة ، فضلا عن تاثير مضاد لليفي قوي. ومع ذلك, عندما يتم أداره راباميسين بالمنهجية, الآثار الجانبية الشائعة (علي سبيل المثال, فرط الدهون, فقر الدم, نقص الصفيحات) يمكن ان تكون واضحة3. والغرض من منهجيتنا هو تطوير وسيله لإيصال المخدرات المحلية عمليا لاستخدامها في مجري التنفس من شانها ان تقلل من هذه الآثار الجهازية. تركز تقييماتنا علي التحقيق في الاستجابة المناعية المحلية لبناء تسليم المخدرات ، فضلا عن قدرتها علي كبح وظيفة الخلايا الليفية وتغيير البيئة المناعية المحلية. وتشمل النتائج الخاصة بالمرض في اختبار الجسم الذي يقيم علامات التليف.
وقد استخدمت الدعامات القابلة للتحلل من المخدرات في النماذج الحيوانية من الامراض في أنظمه الأعضاء المتعددة ، بما في ذلك مجري التنفس4. لأداره تضيق المسالك الهوائية أو الانهيار ، وقد استخدمت التحقيقات السابقة المخدرات المغلفة السيليكون والدعامات القائمة علي النيكل5. تم اختيار بناء PLLA-PCL لهذا الأسلوب بالذات بسبب الشخصية الخاصة به الإدمان المخدرات والقوه الميكانيكية في الظروف الفسيولوجية علي مدي فتره من 3 أسابيع, وقد ثبت في الدراسات المنشورة السابقة6. PLLA-PCL هو أيضا ماده متوافقة بيولوجيا وقابله للتحلل بالفعل وافقت عليها FDA4. وقد درست الدعامات المتوافقة مع الحيوية سيسبلاتين و MMC في نماذج الحيوانية الكبيرة مثل الأرانب والقطط. ومع ذلك ، في هذه النماذج الحيوانية ، لم توضع الدعامات في نموذج حيواني من المرض وزرعت transcervically. توفر هذه الدراسة طريقه فريدة لتقييم الدعامات المتوافقة مع الادويه الحيوية التي توضع عبر الفم في نموذج الماوس لإصابات المسالك الهوائية وتضيق الحنجرة. والدعامة الحيوية التي تفلت من المخدرات المناعية محليا ويمكن تصغيرها للدراسة في نموذج murine هي قيمه للبحوث السريرية المسبقة الانتقالية. المحاولات السابقة في استخدام الدعامات مع المواد الأخرى بنيات ولدت استجابات قويه الجسم الغريبة تفاقم التهاب الكامن الذي يميز الجهاز7. هذه المنهجية ، علي حد علمنا ، هي الاولي من نوعها لدراسة الآثار المناعية والمضادة لليفي لنظام توصيل الادويه المرتكزة علي الدعامات في نموذج murine من لتر. نموذج murine نفسه يوفر العديد من المزايا لدراسة اثار المخدرات المناعية علي القصبة الهوائية. ويمكن دراسة الفئران المعدلة وراثيا والأفواج التجريبية من الفئران الصحية والمريضة ، والتي يمكن ان تؤدي إلى استنساخ التجريبية وتحسين فعاليه التكلفة. وعلاوة علي ذلك ، فان تسليم الدعامة transorally في القصبة الهوائية الماوس يحاكي التسليم السريري لهذه الدعامة في البشر ، والتي تسلط الضوء كذلك علي ميزه متعديه من هذه الطريقة. وأخيرا ، السهولة النسبية التي يمكن ان تنتج الدعامة PLLA-PCL مع المخدرات يسمح للتعديلات لتقديم العلاجات الدوائية البديلة التي تهدف إلى الحد من تشكيل ندبه في القصبة الهوائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الأكثر اهميه لبناء بنجاح واستخدام الدعامات المخدرات التملص في الجسم الحيوي هي 1) تحديد نسبه PLLA-PCL الأمثل لمعدل الإدمان المخدرات مرغوب فيه ، 2) تحديد التركيز المناسب من المخدرات ليكون التملص ، 3) صب الدعامات حول الاوعيه الدموية لاستخدامها في الجسم الفيفو ، و 4) نقل الدعامات عبر الفم إل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المعهد الوطني لامراض الصمم وغيرها من اضطرابات الاتصال في المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة 1K23DC014082 و 1K23DC014082 (الكسندر هليل). وقد دعمت هذه الدراسة أيضا ماليا من قبل الجمعية الثلاثية والكلية الامريكيه للجراحين (الكسندر هليل) ، ومؤسسه الجمعية الطبية الامريكيه ، شيكاغو ، IL (Madhavi Duvvuri) ومنحه T32 NIDCD التدريب (كيفن Motz).
Materials
| 1. For stent | |||
| 22-gauge angiocatheter | Jelco | 4050 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997-100ML | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Available from other vendors as well. |
| PDLGA | Sigma Aldrich | 739955-5G | |
| PLLA-PCL (70 : 30) | Evonik Industries AG | 65053 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| 2. Animal surgery | |||
| Wire brush | Mill-Rose Company | 320101 | |
| 3. For immunohistochemistry staining | |||
| Antigen retrival buffer | Abcam | ab93678 | Available from other vendors as well; acidic pH needed |
| DAPI | Cell Signaling | 8961S | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | Available from other vendors as well. |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | MilliporeSigma | F4135-500ML | |
| Goat anti-rabbit-488 antibody | Lif technology | a11008 | |
| Goat anti-rat-633 antibody | Lif technology | a21094 | |
| Hydrophilic plus slide | BSB7028 | ||
| PBS | ThermoFisher Scientific | 100-10023 | Available from other vendors as well. |
| Rabbit anti-CD3 antibody | Abcam | ab5690 | |
| Rat antiF4/80 antibody | Biolengend | 123101 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | ||
| 4. For quantative PCR | |||
| 0.5mm glass beads | OMNI International | 19-645 | |
| Bead Mill Homoginizer | OMNI International | ||
| Gene Specific Forward/Reverse Primers | Genomic Resources Core Facility | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Power SYBR Green Mastermix | Life Technologies | 4367659 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 80404 | |
| StepOnePlus Real Time PCR system | Life Technologies |
References
- Minnigerode, B., Richter, H. G. Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood. Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).
- Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).
- Kaplan, M. J., et al. Systemic Toxicity Following Administration of Sirolimus (formerly Rapamycin) for Psoriasis. Archives of Dermatology. 135 (5), 553-557 (1999).
- Kalra, A., et al. New-Generation Coronary Stents: Current Data and Future Directions. Currrent Atherosclerosis Reports. 19 (3), 14 (2017).
- Chao, Y. K., Liu, K. S., Wang, Y. C., Huang, Y. L., Liu, S. J. Biodegradable cisplatin-eluting tracheal stent for malignant airway obstruction: in vivo and in vitro studies. Chest. 144 (1), 193-199 (2013).
- Duvvuri, M., et al. Engineering an immunomodulatory drug-eluting stent to treat laryngotracheal stenosis. Biomaterials Science. 7 (5), 1863-1874 (2019).
- Mugru, S. D., Colt, H. G. Complications of silicone stent insertion in patients with expiratory central airway collapse. Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 1870-1877 (2007).
- Hillel, A. T., et al. An in situ, in vivo murine model for the study of laryngotracheal stenosis. JAMA Otolaryngolology Head Neck Surgery. 140 (10), 961-966 (2014).
- Can, E., Udenir, G., Kanneci, A. I., Kose, G., Bucak, S. Investigation of PLLA/PCL blends and paclitaxel release profiles. AAPS PharmSciTech. 12 (4), 1442-1453 (2011).
- Wang, T., et al. Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model. Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).
- Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents. Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10 (2015).
- Robey, T. C., et al. Use of internal bioabsorbable PLGA “finger-type” stents in a rabbit tracheal reconstruction model. Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).
