Diseño de un Stent Traqueal De la Droga-Eluting Biocompatible en Ratones con Estenosis Laringotraqueal
Summary
La estenosis laringotraqueal es el resultado de la deposición patológica de cicatrices que estrecha críticamente las vías respiratorias traqueales y carece de terapias médicas eficaces. Utilizando un stent PLLA-PCL (70% poli-L-lactide y 30% policaprolactone) como un sistema local de administración de fármacos, se pueden estudiar posibles terapias destinadas a disminuir la proliferación de cicatrices en la tráquea.
Abstract
La estenosis laringotraqueal (LTS) es un estrechamiento patológico de la subglotis y la tráquea que conduce a la obstrucción extratorácica y a una dificultad respiratoria significativa. LTS es el resultado de una lesión mucosa de un cuerpo extraño en la tráquea, que conduce a daño tisular y una respuesta inflamatoria local que va mal, lo que conduce a la deposición de tejido cicatricial patológico. El tratamiento para LTS es quirúrgico debido a la falta de terapias médicas eficaces. El propósito de este método es construir un stent biocompatible que se puede miniaturizar para colocar en ratones con LTS. Demostramos que una construcción PLLA-PCL (70% poli-L-lactide y 30% policaprolactona) tenía una resistencia biomecánica óptima, era biocompatible, factible para un stent de colocación in vivo y capaz de eludir el fármaco. Este método proporciona un sistema de administración de fármacos para probar varios agentes inmunomoduladores para inhibir localmente la inflamación y reducir la fibrosis de las vías respiratorias. La fabricación de los stents toma de 28 a 30 h y se puede reproducir fácilmente, lo que permite experimentos con grandes cohortes. Aquí incorporamos el fármaco rapamicina dentro del stent para probar su eficacia en la reducción de la fibrosis y la deposición de colágeno. Los resultados revelaron que las tiendas PLLA-PCL mostraron una liberación confiable de rapamicina, eran mecánicamente estables en condiciones fisiológicas y eran biocompatibles, induciendo poca respuesta inflamatoria en la tráquea. Además, los stents PLLA-PCL que eluyen la rapamicina redujeron la formación de cicatrices en la tráquea in vivo.
Introduction
La estenosis laringotraqueal (LTS) es un estrechamiento patológico de la tráquea más a menudo debido a una lesión iatrogénica después de la intubación. La combinación de la colonización bacteriana, la respuesta del cuerpo extraño a una traqueotomía o tubo endotraqueal, y los factores específicos del paciente conducen a una respuesta inflamatoria aberrante. Esta respuesta inmunitaria maladaptista conduce a la deposición de colágeno en la tráquea, lo que resulta en estrechamiento luminal de la tráquea y la estenosis posterior1,2. Como el tratamiento actual para esta enfermedad es principalmente quirúrgico, se ha estudiado el desarrollo de un paradigma de tratamiento alternativo basado en la medicina dirigido a las vías inflamatorias y profibroticas aberrantes que conducen a la deposición excesiva de colágeno. La rapamicina, que inhibe el complejo de señalización mTOR, ha demostrado tener efectos inmunosupresores, así como un efecto antifibroblasto robusto. Sin embargo, cuando se administra rapamicina sistémicamente, efectos secundarios comunes (por ejemplo, hiperlipidemia, anemia, trombocitopenia) pueden pronunciarse3. El propósito de nuestra metodología es desarrollar un vehículo para la administración local de drogas factible para su uso en las vías respiratorias que disminuiría estos efectos sistémicos. Nuestras evaluaciones se centran en investigar la respuesta inmune local a la construcción de administración de fármacos, así como su capacidad para inhibir la función de fibroblastos y alterar el microambiente inmune local. Los resultados específicos de la enfermedad incluyen pruebas in vivo que evalúan marcadores de fibrosis.
Los stents biodegradables para elución de fármacos se han utilizado en modelos animales de enfermedad en múltiples sistemas de órganos, incluidas las víasrespiratorias 4. Para el manejo de la estenosis o colapso de las vías respiratorias, investigaciones anteriores han utilizado silicona recubierta de drogas y stents a base de níquel5. Una construcción PLLA-PCL fue elegida para este método particular debido a su perfil de elución de fármacos y fuerza mecánica en condiciones fisiológicas durante un período de 3 semanas, que se ha demostrado en estudios publicados anteriores6. PLLA-PCL es también un material biocompatible y biodegradable ya aprobado por la FDA4. Se han estudiado stents biocompatibles que eluyen cisplatino y MMC en modelos animales grandes como conejos y perros. Sin embargo, en estos modelos animales, los stents no se colocaban en un modelo animal de enfermedad y se implantaban de forma transcervical. Este estudio proporciona un método único para evaluar un stent de elución de fármacos biocompatible colocado transoralmente en un modelo de ratón de lesión en las vías respiratorias y estenosis laringotraqueal. Un stent biocompatible que eluye un fármaco inmunomodulador localmente y puede ser miniaturizado para su estudio en un modelo murino es valioso para la investigación preclínica traslacional. Los intentos anteriores de utilización de stent con otras construcciones de material generaron respuestas robustas de cuerpos extraños que empeoran la inflamación subyacente que distingue LTS7. Esta metodología, hasta nuestro conocimiento, es la primera de su tipo en estudiar los efectos inmunomoduladores y antifibrométicos de un sistema de administración de fármacos basado en stent en un modelo murino de LTS. El modelo murino en sí ofrece varias ventajas para el estudio de los efectos de un fármaco inmunomodulador en la tráquea. Se pueden estudiar ratones modificados genéticamente y cohortes experimentales de ratones sanos y enfermos, lo que puede conducir a la reproducibilidad experimental y mejorar la rentabilidad. Además, la entrega del stent transoralmente en la tráquea del ratón imita la entrega clínica de tal stent en humanos, lo que pone de relieve aún más la ventaja traslacional de este método. Por último, la relativa facilidad con la que se puede producir el stent PLLA-PCL con el fármaco permite modificaciones para ofrecer terapias alternativas dirigidas a reducir la formación de cicatrices en la tráquea.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos más críticos para construir y usar con éxito un stent de elución de drogas in vivo son 1) determinar la relación PLLA-PCL óptima para la tasa de elución de fármacos deseable, 2) determinar la concentración adecuada de fármaco a eluir, 3) moldear los stents alrededor del angiocatéter para uso in vivo, y 4) entrega transoralmente el stent en los ratones después de la inducción LTS sin causar obstrucción fatal de las vías respiratorias.
Si bien existen varios métodos par…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Instituto Nacional sobre la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio 1K23DC014082 y 1R21DC017225 (Alexander Hillel). Este estudio también fue apoyado financieramente por la Sociedad Tríológica y el Colegio Americano de Cirujanos (Alexander Hillel), la American Medical Association Foundation, Chicago, IL (Madhavi Duvvuri) y una beca de capacitación T32 NIDCD (Kevin Motz).
Materials
| 1. For stent | |||
| 22-gauge angiocatheter | Jelco | 4050 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997-100ML | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Available from other vendors as well. |
| PDLGA | Sigma Aldrich | 739955-5G | |
| PLLA-PCL (70 : 30) | Evonik Industries AG | 65053 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| 2. Animal surgery | |||
| Wire brush | Mill-Rose Company | 320101 | |
| 3. For immunohistochemistry staining | |||
| Antigen retrival buffer | Abcam | ab93678 | Available from other vendors as well; acidic pH needed |
| DAPI | Cell Signaling | 8961S | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | Available from other vendors as well. |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | MilliporeSigma | F4135-500ML | |
| Goat anti-rabbit-488 antibody | Lif technology | a11008 | |
| Goat anti-rat-633 antibody | Lif technology | a21094 | |
| Hydrophilic plus slide | BSB7028 | ||
| PBS | ThermoFisher Scientific | 100-10023 | Available from other vendors as well. |
| Rabbit anti-CD3 antibody | Abcam | ab5690 | |
| Rat antiF4/80 antibody | Biolengend | 123101 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | ||
| 4. For quantative PCR | |||
| 0.5mm glass beads | OMNI International | 19-645 | |
| Bead Mill Homoginizer | OMNI International | ||
| Gene Specific Forward/Reverse Primers | Genomic Resources Core Facility | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Power SYBR Green Mastermix | Life Technologies | 4367659 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 80404 | |
| StepOnePlus Real Time PCR system | Life Technologies |
References
- Minnigerode, B., Richter, H. G. Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood. Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).
- Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).
- Kaplan, M. J., et al. Systemic Toxicity Following Administration of Sirolimus (formerly Rapamycin) for Psoriasis. Archives of Dermatology. 135 (5), 553-557 (1999).
- Kalra, A., et al. New-Generation Coronary Stents: Current Data and Future Directions. Currrent Atherosclerosis Reports. 19 (3), 14 (2017).
- Chao, Y. K., Liu, K. S., Wang, Y. C., Huang, Y. L., Liu, S. J. Biodegradable cisplatin-eluting tracheal stent for malignant airway obstruction: in vivo and in vitro studies. Chest. 144 (1), 193-199 (2013).
- Duvvuri, M., et al. Engineering an immunomodulatory drug-eluting stent to treat laryngotracheal stenosis. Biomaterials Science. 7 (5), 1863-1874 (2019).
- Mugru, S. D., Colt, H. G. Complications of silicone stent insertion in patients with expiratory central airway collapse. Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 1870-1877 (2007).
- Hillel, A. T., et al. An in situ, in vivo murine model for the study of laryngotracheal stenosis. JAMA Otolaryngolology Head Neck Surgery. 140 (10), 961-966 (2014).
- Can, E., Udenir, G., Kanneci, A. I., Kose, G., Bucak, S. Investigation of PLLA/PCL blends and paclitaxel release profiles. AAPS PharmSciTech. 12 (4), 1442-1453 (2011).
- Wang, T., et al. Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model. Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).
- Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents. Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10 (2015).
- Robey, T. C., et al. Use of internal bioabsorbable PLGA “finger-type” stents in a rabbit tracheal reconstruction model. Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).
