Progettazione di uno stent tracheale biocompatibile che epelle la droga nei topi con stenosi lariosa
Summary
La stenosi larifica deriva da una deposizione di cicatrici patologiche che restringe criticamente le vie aeree tracheali e manca di terapie mediche efficaci. Utilizzando uno stent PLLA-PCL (70% poli-L-lactide e 30% policaprolactone) come sistema locale di somministrazione di farmaci, possono essere studiate potenziali terapie volte a ridurre la proliferazione della cicatrice nella trachea.
Abstract
La stenosi larifica (LTS) è un restringimento patologico della subglottide e della trachea che porta all’ostruzione extratoracica e alla significativa mancanza di respiro. LTS deriva da lesioni mucose da un corpo estraneo nella trachea, che porta a danni ai tessuti e una risposta infiammatoria locale che va storto, portando alla deposizione del tessuto cicatriziale patologico. Il trattamento per LTS è chirurgico a causa della mancanza di terapie mediche efficaci. Lo scopo di questo metodo è quello di costruire uno stent biocompatibile che può essere miniaturizzato per inserire nei topi con LTS. Abbiamo dimostrato che un costrutto PLLA-PCL (70% poli-L-lactide e 30% policaprolactone) aveva una forza biomeccanica ottimale, era biocompatibile, praticabile per uno stent di posizionamento in vivo e in grado di eluire il farmaco. Questo metodo fornisce un sistema di somministrazione di farmaci per testare vari agenti immunomodulatori per inibire localmente l’infiammazione e ridurre la fibrosi delle vie aeree. La produzione degli stent richiede 28-30 ore e può essere riprodotta facilmente, consentendo esperimenti con grandi coorti. Qui abbiamo incorporato il farmaco rapamicina all’interno dello stent per testare la sua efficacia nel ridurre la fibrosi e la deposizione di collagene. I risultati hanno rivelato che le tende PLLA-PCL mostravano un rilascio affidabile di rapamici, erano meccanicamente stabili in condizioni fisiologiche e erano biocompatibili, inducendo poca risposta infiammatoria nella trachea. Inoltre, gli stent PLLA-PCL che hanno ridotto la formazione di cicatrici nella trachea in vivo.
Introduction
La stenosi larifica (LTS) è un restringimento patologico della trachea più spesso a causa di lesioni post-intubazione iatrogene. La combinazione di colonizzazione batterica, risposta del corpo estraneo a una tracheostomia o tubo endotrachiale, e fattori specifici del paziente portano ad una risposta infiammatoria aberrante. Questa risposta immunitaria disadattata porta alla deposizione di collagene nella trachea, con conseguente restringimento luminale della trachea e successiva stenosi1,2. Poiché l’attuale trattamento per questa malattia è principalmente chirurgico, è stato studiato lo sviluppo di un paradigma di trattamento alternativo basato sulla medicamente che mira alle vie infiammatorie e profibrotiche aberranti che portano a una deposizione eccessiva di collagene. La rapamicia, che inibisce il complesso di segnalazione mTOR, ha dimostrato di avere effetti immunosoppressivi e un robusto effetto antifibroblasto. Tuttavia, quando la rapamicia è somministrata sistemicamente, gli effetti collaterali comuni (ad esempio, iperlipidemia, anemia, trombocitopenia) possono essere pronunciati3. Lo scopo della nostra metodologia è quello di sviluppare un veicolo per la somministrazione di farmaci locali praticabile per l’uso nelle vie aeree che diminuirebbe questi effetti sistemici. Le nostre valutazioni si concentrano sullo studio della risposta immunitaria locale al costrutto di somministrazione di farmaci, nonché sulla sua capacità di inibire la funzione del fibroblasto e alterare il microambiente immunitario locale. Gli esiti specifici della malattia includono test in vivo che valutano i marcatori della fibrosi.
Stent biodegradabili che eludino farmaci sono stati utilizzati in modelli animali di malattia in sistemi di organi multipli, tra cui le vie respiratorie4. Per la gestione della stenosi delle vie aeree o del collasso, indagini precedenti hanno utilizzato stent a base di silicone e nichel rivestiti di farmaci5. Un costrutto PLLA-PCL è stato scelto per questo particolare metodo a causa del suo profilo di eluzione di farmaci e della forza meccanica in condizioni fisiologiche per un periodo di 3 settimane, che è stato dimostrato in precedenti studi pubblicati6. PLLA-PCL è anche un materiale biocompatibile e biodegradabile già approvato dalla FDA4. Gli stent biocompatibili che elucano cisplatina e MMC sono stati studiati in grandi modelli animali come conigli e cani. Tuttavia, in questi modelli animali, gli stent non sono stati collocati in un modello animale di malattia e sono stati impiantati transcervicalmente. Questo studio fornisce un metodo unico per valutare uno stent biocompatibile che epelle farmaci collocato in modo transorale in un modello murino di lesioni delle vie aeree e stenosi largotrale. Uno stent biocompatibile che eluisce un farmaco immunomodulatore localmente e può essere miniaturizzato per lo studio in un modello murino è prezioso per la ricerca preclinica traslazionale. I precedenti tentativi di utilizzo dello stent con altri costrutti materiali hanno generato solide risposte del corpo estraneo che peggiorano l’infiammazione sottostante che distingue LTS7. Questa metodologia, a nostra conoscenza, è la prima nel suo genere a studiare gli effetti immunomodulati e antifibrotici di un sistema di somministrazione di farmaci a base di stent in un modello murino di LTS. Il modello murino stesso offre diversi vantaggi per studiare gli effetti di un farmaco immunomodulatore sulla trachea. Possono essere studiati topi geneticamente modificati e coorti sperimentali di topi sani e malati, che possono portare alla riproducibilità sperimentale e migliorare l’efficacia in termini di costi. Inoltre, la consegna dello stent transoralmente nella trachea del topo imita la consegna clinica di tale stent negli esseri umani, che evidenzia ulteriormente il vantaggio traslazionale di questo metodo. Infine, la relativa facilità con cui lo stent PLLA-PCL con il farmaco può essere prodotta consente modifiche per fornire terapie farmacologiche alternative volte a ridurre la formazione di cicatrici nella trachea.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi più critici per costruire e utilizzare con successo uno stent in vivo che elui scandiet a un farmaco sono 1) che determinano il rapporto PLLA-PCL ottimale per il tasso di eguagliazione del farmaco desiderabile, 2) determinando l’adeguata concentrazione del farmaco da eluire, 3) modellare gli stent intorno all’angiocatere per l’uso in vivo, e 4) consegnando transoralmente lo stent nei topi dopo l’induzione della LTS senza causare ostruzione fatale delle vie aeree.
Mentre ci sono div…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Istituto nazionale di sordità e altri disturbi della comunicazione dei National Institutes of Health con il numero 1K23DC014082 e 1R21DC017225 (Alexander Hillel). Questo studio è stato anche sostenuto finanziariamente dalla Triological Society e dall’American College of Surgeons (Alexander Hillel), dall’American Medical Association, Chicago, IL (Madhavi Duvvuri) e da una sovvenzione di formazione T32 NIDCD (Kevin Motz).
Materials
| 1. For stent | |||
| 22-gauge angiocatheter | Jelco | 4050 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 270997-100ML | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Available from other vendors as well. |
| PDLGA | Sigma Aldrich | 739955-5G | |
| PLLA-PCL (70 : 30) | Evonik Industries AG | 65053 | |
| Rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| 2. Animal surgery | |||
| Wire brush | Mill-Rose Company | 320101 | |
| 3. For immunohistochemistry staining | |||
| Antigen retrival buffer | Abcam | ab93678 | Available from other vendors as well; acidic pH needed |
| DAPI | Cell Signaling | 8961S | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | Available from other vendors as well. |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | MilliporeSigma | F4135-500ML | |
| Goat anti-rabbit-488 antibody | Lif technology | a11008 | |
| Goat anti-rat-633 antibody | Lif technology | a21094 | |
| Hydrophilic plus slide | BSB7028 | ||
| PBS | ThermoFisher Scientific | 100-10023 | Available from other vendors as well. |
| Rabbit anti-CD3 antibody | Abcam | ab5690 | |
| Rat antiF4/80 antibody | Biolengend | 123101 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | ||
| 4. For quantative PCR | |||
| 0.5mm glass beads | OMNI International | 19-645 | |
| Bead Mill Homoginizer | OMNI International | ||
| Gene Specific Forward/Reverse Primers | Genomic Resources Core Facility | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Power SYBR Green Mastermix | Life Technologies | 4367659 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 80404 | |
| StepOnePlus Real Time PCR system | Life Technologies |
References
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