동물 향 신호 샘플링 및 분석
Summary
우리는 동물 통신에서 어떻게 사용될 수 있는지 이해하기 위해 악취 신호를 샘플링하고 분석하기위한 효과적인 방법론을 개발했습니다. 특히, 우리는 동물 냄새와 향기 표시의 휘발성 성분을 분석하기 위해 가스 크로마토그래피 질량 분석과 결합 된 헤드 스페이스 고체 위상 미세 추출을 사용합니다.
Abstract
우리는 가스 크로마토그래피 질량 분광법과 결합된 헤드스페이스 고형 마이크로추출을 사용하여 악취 신호를 샘플링하고 분석하기 위한 효과적인 방법론을 개발하여 동물 통신에 어떻게 사용될 수 있는지 를 이해했습니다. 이 기술은 시료내의 성분의 분리 및 잠정적인 식별을 가능하게 함으로써 악취 분비물의 휘발성 성분의 반정적 분석을 가능하게 하고, 피크 면적 비율의 분석은 신호에 관여할 수 있는 화합물을 나타낼 수 있는 추세를 찾아낸다. 이 현재 접근 방식의 주요 강점은 분석할 수 있는 샘플 유형의 범위입니다. 복잡한 시료 준비 또는 추출에 대한 필요성의 부족; 혼합물의 성분을 분리하고 분석하는 능력; 검출된 구성 요소의 식별; 및 검출된 구성 요소에 대한 반정적 및 잠재적으로 정량적 정보를 제공하는 기능. 방법론에 대한 주요 제한사항은 샘플 자체와 관련이 있습니다. 특정 관심의 구성 요소는 휘발성이 있기 때문에, 이들은 쉽게 손실 될 수 있기 때문에, 또는 그들의 농도 변경, 샘플 저장 및 수집 후 적절 하 게 전송 하는 것이 중요 하다. 이는 또한 샘플 저장 및 운송 조건이 상대적으로 비용이 많이 든다는 것을 의미합니다. 이 방법은 다양한 샘플(소변, 대변, 모발 및 향기-동맥 냄새 분비물 포함)에 적용될 수 있다. 이러한 냄새는 다양한 행렬에서 발생하는 복잡한 혼합물로 구성되므로 개별 성분을 분리하고 생물학적 관심의 화합물을 추출하는 기술의 사용이 필요합니다.
Introduction
동물1의후각 신호를 뒷받침하는 화학적 변화에 대해서는 거의 알려져 하지 않으며, 악취2의휘발성 화학 프로파일을 기록하고 정량화하는 방법론적 과제도 알려져 있다. 매우 복잡 한 작업 하는 경우 몇 가지 잠재적인 함정이 있다, 화학 행렬; 여기에는 악취 샘플을 샘플링하고 분석할 때3이포함됩니다.
울버햄프턴 대학교로잘린드 프랭클린 과학 센터에서 우리는 동물들이 어떻게 사용될 수 있는지 이해하기 위해 냄새와 향기 를 분석하고 있습니다. 우리는 반화학과 행동 생태학, 내분비학 및 세포학을 결합하여 동물 통신에서 후각 신호가 수행하는 역할에 대한 이해를 향상시킵니다.
우리는 방법론을 개발한 다음 여러 비인간 영장류 (즉, 여우원숭이, 빨간 주름 여우원숭이, 일본 원숭이, 올리브 개코원숭이, 침팬지) 및 기타 포유동물 (즉, 고양이, 소)을 포함한 다양한 종의 냄새와 표시를 분석했습니다. 소변, 대변, 모발 및 향기 냄새 분비물 등 다양한 샘플을 수집하고 분석했습니다. 이러한 냄새와 향기 마크는 화합물의 복잡한 혼합물로 구성되므로 분석에 사용되는 모든 방법론은 일종의 분리 기술을 포함해야합니다. 그림과 같이, 그들은 또한 관심있는 구성 요소를 추출하는 기술의 사용을 필요로 행렬의 범위에서 발생합니다.
Vaglio 외.4 및 다른저자5에 의한 이전 연구는 가스 크로마토그래피 질량 분광법 (GC-MS)을 사용한 동적 헤드 스페이스 추출 (DHS)을 사용했으며 직접 용매 추출6 및 복잡한 용매 추출7도 사용되었습니다. 특히 동적 헤드스페이스 샘플링은 시료 매트릭스(예: 수성 시료의 극지 화합물)에 대한 강한 친화력을 보이는 화합물을 제외한 모든 휘발성 화합물을 궁극적으로 제거하는 불활성 가스의 알려진 부피로 헤드스페이스를 제거하는 것을 포함한다.
현재 방법론의 경우, 우리는 GC-MS와 결합 헤드 스페이스 고체 위상 미세 추출 (HS-SPME)의 기술을 채택했다. 특히, 우리는 이전 GC-MS 실험실8,9,10에서Vaglio 등에서 이미 사용된 방법론을 개발하고강화했습니다.
용매없는 추출 기술은 이러한 방법이 안정적이고 고체 상 지원에 화합물을 고정하기 때문에 작고 휘발성이 높은 화합물 (그렇지 않으면 샘플에서 쉽게 손실 될 수 있음)을 분석하는 데 매우 효과적입니다. HS-SPME는 흡착 성 폴리머로 코팅된 섬유를 사용하여 시료 헤드스페이스에서 휘발성 화합물을 포획하거나 수성 생물학적유체(11)에침수하여 용존 화합물을 추출한다. 폴리머 코팅은 화합물을 강하게 결합하지 않으므로 GC의 사출 포트에서 가열함으로써 제거할 수 있다. 이 방법은 용매 추출 기술보다 더 강력하며 DHS보다 더 효과적입니다.
현재 접근 방식에서 샘플은 유리 바이알 내에 포함되어 있습니다. 이러한 바이알은 바이알의 헤드 스페이스를 점유하기 위해 향기마크의 휘발성 성분을 촉진하기 위해 동물의 체온을 시뮬레이션하기 위해 40°C의 온도로 따뜻해질 수 있다. 폴리디메틸실록산/디비닐벤젠(PDMS/DVB) 셔벤트 소재의 65 μm로 코팅된 SPME 섬유는 헤드스페이스 환경에 노출되고 샘플로부터휘발성 성분이 섬유에 흡착된다. GC-MS의 입구 포트에서 섬유를 가열할 때, 휘발성 성분은 섬유로부터 탈광된 다음 GC에 의해 분리된다. 질량 스펙트럼 단편화 패턴은 MS를 사용하여 각 구성 요소에 대해 얻어진다. 질량 스펙트럼 데이터베이스에 대한 이러한 질량 스펙트럼을 비교하여 향기 마크의 구성 요소를 잠정적으로 식별할 수 있습니다. 자동 샘플러를 사용하여 여러 샘플을 일괄 처리방식으로 일관되게 분석할 수 있습니다.
SPME 섬유의 각 유형은 극성 화학 물질과 상이한 친화력을 가지고 있음을 감안할 때, 섬유는 일반적으로 대상 화학 화합물의 극성 및 / 또는 분자량에 따라 선택됩니다. 또한, GC 조건은 GC 컬럼의 종류와 표적 화학 화합물의 특성에 따라 변경된다.
이 기술을 통해 샘플내 부품의 분리 및 잠정식별을 가능하게 함으로써 향기 표시의 휘발성 성분을 반정적으로 분석한 다음, 피크 영역 비율을 분석하여 신호에 관여할 수 있는 향기 표시의 구성 요소를 나타낼 수 있는 추세를 찾을 수 있습니다.
이 현재 접근 방식의 주요 강점은 다음과 같습니다.
- 분석할 수 있는 샘플 유형의 범위입니다.
- 복잡한 시료 준비 나 추출이 필요하지 않습니다.
- 휘발성 구성 요소를 분석할 수 있는 기능입니다.
- 혼합물의 성분을 분리하는 기능.
- 검출된 구성 요소를 식별할 수 있습니다.
- 검출된 구성 요소에 대한 반정적 및 잠재적으로 정량적인 정보를 제공하는 기능.
Protocol
Representative Results
Discussion
샘플 수집 시 생성된 환경 제어와 시스템 블랭크 모두 제어 샘플의 사용은 향기 마크 샘플을 해석하는 데 매우 중요합니다. 샘플링 환경이나 기악 시스템에 기인하는 모든 피크는 관심 의 피크만 해석에 포함되도록 향기 표시 샘플에서 제외해야합니다. 이러한 컨트롤은 계측의 ‘상태’를 평가하고 모니터링하는 역할도 할 수 있습니다.
프로토콜에는 각 추출 전후에 섬유를 조?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 비디오의 제작에 대한 로잘린드 프랭클린 과학 센터, 울버햄프턴, 벤 맨틀에서 화학 분석에 대한 그의 도움에 대한 키스 홀딩 감사합니다. 또한 글로리아노 모네티 교수, 주세페 피에라치니 박사, 피렌체 의 질량 분석 센터, 피렌체, 그리고 CNR의 ARCA 연구소의 루카 칼라마이 교수와 마르코 미켈로즈지 박사에게 감사드리며, 이 방법론을 설정하는 데 도움을 주었습니다. 원고에 설명된 샘플링 및 분석 방법을 포함한 연구 프로젝트는 영국 영장류 협회의 작은 보조금 (327083, 703611), 작은 보조금(‘감각농축 영장류’)영국 영장류 협회의 마리 Skłodowska-Curie Intra 유럽 펠로우십 (보조금 계약 IDs) 및 작은 연구 보조금 (사냥꾼수집가)에의해 지원되었다.’ 이 방법론을 설정하는 데 필요한 실험실 작업은 또한 S.V.에 과학 및 공학의 연간 자금 조달 대회 (울버햄프턴)의 학부에서 자금을 받았다.
Materials
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | – | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | – | Excel |
| Spectral library | NIST | – | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | – | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
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