Summary

Muestreo y análisis de señales de olor animal

Published: February 13, 2021
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Summary

Hemos desarrollado una metodología eficaz para el muestreo y análisis de señales de olor con el fin de comprender cómo se pueden utilizar en la comunicación animal. En particular, utilizamos la microextracción de fase sólida del espacio de la cabeza junto con la cromatografía de gases y la espectrometría de masas para analizar los componentes volátiles de los olores y las marcas de olor de los animales.

Abstract

Hemos desarrollado una metodología eficaz para el muestreo y análisis de señales de olor, mediante el uso de microextracción en fase sólida del espacio de la cabeza junto con cromatografía de gases-espectrometría de masas, para entender cómo se pueden utilizar en la comunicación animal. Esta técnica permite el análisis semicuantitativo de los componentes volátiles de las secreciones de olores al permitir la separación e identificación tentativa de los componentes de la muestra, seguido del análisis de las relaciones de área de pico para buscar tendencias que pudieran significar compuestos que pudieran estar involucrados en la señalización. Las fortalezas clave de este enfoque actual son el rango de tipos de muestras que se pueden analizar; la falta de necesidad de cualquier preparación o extracción de muestras complejas; la capacidad de separar y analizar los componentes de una mezcla; la identificación de los componentes detectados; y la capacidad de proporcionar información semicuantitativa y potencialmente cuantitativa sobre los componentes detectados. La principal limitación de la metodología se refiere a las propias muestras. Dado que los componentes de interés específico son volátiles, y estos podrían perderse fácilmente, o alterar sus concentraciones, es importante que las muestras se almacenen y transporten adecuadamente después de su recolección. Esto también significa que las condiciones de almacenamiento y transporte de muestras son relativamente costosas. Este método se puede aplicar a una variedad de muestras (incluyendo orina, heces, cabello y secreciones de olor de glándulas olfativas). Estos olores consisten en mezclas complejas, que ocurren en una gama de matrices, y por lo tanto requieren el uso de técnicas para separar los componentes individuales y extraer los compuestos de interés biológico.

Introduction

Se sabe muy poco acerca de los cambios químicos que sustentan las señales olfativas en animales1, también debido a los desafíos metodológicos en el registro y cuantificación de perfiles químicos volátiles de olores2. Hay varios escollos potenciales cuando se trabaja con matrices químicas altamente complejas; estos incluyen al tomar muestras y analizar las muestras de olor3.

En el Rosalind Franklin Science Center de la Universidad de Wolverhampton, estamos llevando a cabo el análisis de olores y marcas de olor para comprender cómo pueden ser utilizados por los animales. Combinamos la semioquímica con la ecología del comportamiento, la endocrinología y la citología para mejorar nuestra comprensión del papel que desempeñan las señales olfativas en la comunicación animal.

Hemos desarrollado una metodología y luego analizado olores y marcas de una variedad de especies, incluidos varios primates no humanos (es decir, lémures coronados, lémures de volantes rojos, macacos japoneses, babuinos olivares, chimpancés) y otros mamíferos (es decir, gatos, vacas). Hemos recogido y analizado una variedad de muestras, incluyendo orina, heces, cabello y secreciones de olor de glándulas olfativas. Estos olores y marcas de olor consisten en mezclas complejas de compuestos y, por lo tanto, cualquier metodología utilizada para su análisis debe incluir alguna forma de técnica de separación. Como se ilustra, también se producen en una serie de matrices que requiere el uso de técnicas para extraer los componentes de interés.

Estudios previos de Vaglio et al.4 y otros autores5 utilizaron la extracción dinámica del espacio de cabeza (DHS) con cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), mientras que la extracción directa con disolvente6 y las extracciones complejascon disolventes 7 también se han utilizado. En particular, el muestreo dinámico del espacio de cabeza implica purgar el espacio de cabeza con un volumen conocido de gas inerte que, en última instancia, elimina todos los compuestos volátiles con la excepción de aquellos que muestran una fuerte afinidad por la matriz de la muestra (por ejemplo, compuestos polares en muestras acuosas).

Para la metodología actual, hemos adoptado la técnica de microextracción en fase sólida del espacio de la cabeza (HS-SPME) junto con GC-MS. En particular, hemos desarrollado y mejorado la metodología ya utilizada por Vaglio et al. en su anterior laboratorio GC-MS8,9,10.

Las técnicas de extracción sin solventes son muy efectivas para analizar compuestos pequeños y altamente volátiles (que de lo contrario se pueden perder fácilmente de una muestra) porque estos métodos inmovilizan los compuestos en un soporte de fase estable y sólido. El HS-SPME utiliza una fibra recubierta con un polímero adsorbente para capturar compuestos volátiles en el espacio de la cabeza de la muestra o para extraer compuestos disueltos por inmersión en un fluido biológico acuoso11. La capa del polímero no ata los compuestos fuertemente, por lo tanto calentando en el puerto de la inyección de la CROMATOGRAFÍA GASEOSA pueden ser quitados. Este método es más potente que las técnicas de extracción con disolventes y también más eficaz que el DHS.

En el enfoque actual, las muestras están contenidas dentro de viales de vidrio. Estos viales se calientan a una temperatura de 40 °C para simular la temperatura corporal del animal con el fin de promover que los componentes volátiles de la marca de olor ocupen el espacio de la cabeza del vial. Una fibra SPME, recubierta con 65 μm de material sorbente de polidimetilsiloxano/divinilbenceno (PDMS/DVB), se expone al entorno del espacio de la cabeza y los componentes volátiles de la muestra se adsorben en la fibra. Al calentar la fibra en el puerto de entrada de un GC-MS, los componentes volátiles se desorben de la fibra y luego se separan por el GC. Los patrones de fragmentación espectral de masa se obtienen para cada componente utilizando la EM. Mediante la comparación de estos espectros de masas con las bases de datos espectrales de masas, puede ser posible identificar tentativamente los componentes de la marca de olor. A través del uso de un auto-muestreador, somos capaces de analizar múltiples muestras en lotes de una manera consistente.

Dado que cada tipo de fibra SPME tiene una afinidad diferente con los productos químicos polares, la fibra generalmente se elige dependiendo de la polaridad y / o peso molecular de los compuestos químicos objetivo. Además, las condiciones de GC se cambian dependiendo del tipo de columna gc y las características de los compuestos químicos objetivo.

Esta técnica permite el análisis semicuantitativo de los componentes volátiles de las marcas de olores al permitir la separación e identificación tentativa de los componentes en la muestra, seguida del análisis de las relaciones de área de pico para buscar tendencias que podrían significar componentes de la marca de olores que pueden estar involucrados en la señalización.

Los puntos fuertes clave de este enfoque actual son:

  • El rango de tipos de muestra que se pueden analizar.
  • No se requiere preparación de muestras complejas ni extracciones.
  • La capacidad de analizar componentes volátiles.
  • La capacidad de separar los componentes de una mezcla.
  • Poder identificar los componentes detectados.
  • La capacidad de proporcionar información semicuantitativa y potencialmente cuantitativa sobre los componentes detectados.

Protocol

1. Recogida de muestras Olores de muestra que son uno de los siguientes: Recolectar liberadas espontáneamente por sujetos de estudio habituados (por ejemplo, primates de zoológicos) a través de la marca de olores en papel de filtro estéril (por ejemplo, secreciones de olor de glándulas olfativas) o directamente en viales (por ejemplo, orina). Recoger frotando hisopos de algodón estériles después de la formación de los sujetos de estudio mediante el uso de entrenamiento de refuerzo po…

Representative Results

Siguiendo este protocolo, identificamos tentativamente un total de 32 compuestos químicos volátiles a partir del análisis de 14 marcas de olor ano-genitales liberadas espontáneamente en papel de filtro por lémures rojizos(Varecia variegata rubra)y comparamos perfiles de olor con características del señalizador12. Los compuestos volátiles naturales, tales como hidrocarburos, terpenos, alcoholes del terpeno y cetonas, estaban presentes dentro de estos perfiles e incluyeron los compu…

Discussion

El uso de muestras de control, tanto los controles ambientales creados en el momento de la recolección de muestras como los espacios en blanco del sistema, son cruciales para la interpretación de las muestras de marcas de olor. Los picos atribuidos al entorno de muestreo o al sistema instrumental deben excluirse de las muestras de marcas de olores para que solo los picos de interés se incluyan en cualquier interpretación. Estos controles también pueden desempeñar un papel en la evaluación y supervisión de la “sal…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Keith Holding por su asistencia con los análisis químicos en el Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton, y a Ben Mantle por la producción del video. También estamos agradecidos al Prof. Gloriano Moneti, al Dr. Giuseppe Pieraccini y a los miembros del Centro de Espectrometría de Masas de la Universidad de Florencia, Florencia, y al Prof. Luca Calamai y al Dr. Marco Michelozzi del Laboratorio ARCA del CNR, Florencia, por su ayuda en la creación de esta metodología. Los proyectos de investigación que incluían los métodos de muestreo y análisis descritos en el manuscrito fueron apoyados por dos becas intraeuropeas Marie Skłodowska-Curie (Grant Agreement IDs: 327083, 703611), una pequeña subvención (‘El primate enriquecido sensorial‘) de la Sociedad de Primates de Gran Bretaña, y una pequeña beca de investigación (‘¿Tienen los cazadores-recolectores un sentido especial del olfato?‘) de la Academia Británica/The Leverhulme Trust a S.V. El trabajo de laboratorio necesario para establecer esta metodología también recibió financiación del Concurso Anual de Financiación de la Facultad de Ciencias e Ingeniería (Wolverhampton) a S.V.

Materials

10 mL autosampler vials Agilent 5188-5392 10 ml screwtop vials with
18 mm vial caps Agilent 8010-0139 Magnetic with PTFE/silicone septa
Autosampler Agilent GC120 PAL autosampler
Capillary column Agilent HP5-MS 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm
Data analysis software Agilent ChemStation
Gas Chromatograph Agilent 7890B
Inlet septa Agilent 5182-3442 Merlin microseal
Mass Selective Detector Agilent 5977A
Reporting software Microsoft Excel
Spectral library NIST NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library
Spectral library search program NIST MS Search v.2.2
Splitless Inlet liner Agilent 5190-4048
SPME fibres Agilent SU57345U 65 µm PDMS/DVB fibre

References

  1. Wyatt, T. D. . Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , (2014).
  2. Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
  3. Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The “secret” in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
  4. Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
  5. Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
  6. Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
  7. Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
  8. Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
  9. Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
  10. Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
  11. Pawliszyn, J. . Solid phase microextraction: theory and practice. , (1997).
  12. Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951 (2019).

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Cite This Article
Walker, D., Vaglio, S. Sampling and Analysis of Animal Scent Signals. J. Vis. Exp. (168), e60902, doi:10.3791/60902 (2021).

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