Отбор проб и анализ сигналов запаха животных
Summary
Мы разработали эффективную методологию отбора проб и анализа сигналов запаха, чтобы понять, как они могут быть использованы в общении с животными. В частности, мы используем твердофазную микроэкстракцию пространства над головой в сочетании с газовой хроматографией-масс-спектрометрией для анализа летучих компонентов запахов животных и запаховых меток.
Abstract
Мы разработали эффективную методологию отбора проб и анализа сигналов запаха, используя твердофазную микроэкстракцию пространства над головой в сочетании с газовой хроматографией-масс-спектрометрией, чтобы понять, как они могут быть использованы в общении животных. Этот метод позволяет проводить полуциплиматический анализ летучих компонентов секреций запаха, позволяя разделять и предварительно идентифицировать компоненты в образце с последующим анализом соотношений пиковой площади для поиска тенденций, которые могут означать соединения, которые могут быть вовлечены в передачу сигналов. Ключевыми сильными сторонами этого нынешнего подхода являются диапазон типов образцов, которые могут быть проанализированы; отсутствие необходимости в какой-либо сложной пробоподготовке или извлечении; возможность разделения и анализа компонентов смеси; идентификация обнаруженных компонентов; и способность предоставлять полу количественно-количественную и потенциально количественную информацию об обнаруженных компонентах. Основное ограничение методологии касается самих образцов. Поскольку компоненты, представляющие особый интерес, являются летучими, и они могут быть легко потеряны или их концентрации изменены, важно, чтобы образцы хранились и транспортировались надлежащим образом после их сбора. Это также означает, что условия хранения и транспортировки образцов являются относительно дорогостоящими. Этот метод может быть применен к различным образцам (включая мочу, кал, волосы и выделения запаха ароматических желез). Эти запахи состоят из сложных смесей, встречающихся в ряде матриц, и, таким образом, требуют использования методов для разделения отдельных компонентов и извлечения соединений, представляющих биологический интерес.
Introduction
Очень мало известно о химических изменениях, лежащих в основе обонятельных сигналов у животных1,в том же время из-за методологических проблем в регистрации и количественной оценке летучих химических профилей запахов2. Существует несколько потенциальных ловушек при работе с очень сложными химическими матрицами; к ним относятся при отборе проб и анализе запаха образцов3.
В Научном центре Розалинд Франклин Университета Вулверхэмптона мы проводим анализ запахов и запахов, чтобы понять, как они могут использоваться животными. Мы объединяем семиохимию с поведенческой экологией, эндокринологией и цитологией, чтобы улучшить наше понимание роли обонятельных сигналов в общении животных.
Мы разработали методологию, а затем проанализировали запахи и маркировку различных видов, включая нескольких нечеловеческих приматов (то есть коронованных лемуров, красно-взъерошенные лемуры, японские макаки, оливковые бабуины, шимпанзе) и других млекопитающих (то есть кошек, коров). Мы собрали и проанализировали различные образцы, включая мочу, фекалии, волосы и выделения запаха пахлочек. Эти запахи и запаховые метки состоят из сложных смесей соединений, и поэтому любая методология, используемая для их анализа, должна включать некоторую форму сепараторного метода. Как показано на рисунке, они также встречаются в ряде матриц, что обусловливает необходимость использования методов извлечения интересующих компонентов.
Предыдущие исследования Vaglio et al.4 и других авторов5 использовали динамическую экстракцию в пространстве над головой (DHS) с помощью газовой хроматографии-масс-спектрометрии (GC-MS), в то время как прямая экстракция растворителем6 и комплексная экстракция растворителем7 также использовались. В частности, динамический отбор проб в пространстве над головой включает очистку пространства над головой известным объемом инертного газа, который в конечном итоге удаляет все летучие соединения, за исключением тех, которые демонстрируют сильное сродство к матрице образца (например, полярные соединения в водных образцах).
Для текущей методологии мы приняли метод твердофазной микроэкстракции пространства над головой (HS-SPME) в сочетании с GC-MS. В частности, мы разработали и усовершенствовали методологию, уже используемую Vaglio et al. в своей предыдущей лаборатории GC-MS8,9,10.
Методы экстракции без растворителя очень эффективны для анализа небольших, высоколетучих соединений (которые в противном случае могут быть легко потеряны из образца), поскольку эти методы иммобилизуют соединения на стабильной твердофазной опоре. HS-SPME использует волокно, покрытое адсорбентным полимером, для захвата летучих соединений в пространстве образца или для извлечения растворенных соединений путем погружения в водную биологическую жидкость11. Полимерное покрытие не связывает соединения сильно, поэтому нагреванием в инжекционном порту ГК их можно удалить. Этот метод является более мощным, чем методы экстракции растворителем, а также более эффективным, чем DHS.
При нынешнем подходе образцы содержатся в стеклянных флаконах. Эти флаконы нагревают до температуры 40 °C для имитации температуры тела животного, чтобы способствовать тому, чтобы летучие компоненты аромата занимали пространство головы флакона. Волокно SPME, покрытое 65 мкм сорбентного материала полидиметилсилоксана/дивинилбензола (PDMS/DVB), подвергается воздействию среды пространства над головой, и летучие компоненты из образца адсорбируются на волокно. При нагревании волокна во входном порту GC-MS летучие компоненты десорбируются от волокна, а затем отделяются GC. Паттерны масс-спектральной фрагментации получены для каждого компонента с использованием MS. Сравнивая эти масс-спектры с масс-спектральными базами данных, можно предварительно определить компоненты ароматического знака. Благодаря использованию автоматического пробоотборщика мы можем последовательно анализировать несколько образцов партиями.
Учитывая, что каждый тип волокна SPME имеет различное сродство с полярными химическими веществами, волокно обычно выбирают в зависимости от полярности и/или молекулярной массы целевых химических соединений. Кроме того, условия ГК изменяются в зависимости от типа колонки ГК и характеристик целевых химических соединений.
Этот метод позволяет проводить полуциплиматический анализ летучих компонентов запаховой маркировки, позволяя разделять и предварительно идентифицировать компоненты в образце с последующим анализом коэффициентов пиковой площади для поиска тенденций, которые могли бы означать компоненты ароматовой маркировки, которые могут быть вовлечены в сигнализацию.
Ключевыми сильными сторонами этого нынешнего подхода являются:
- Диапазон типов образцов, которые могут быть проанализированы.
- Не требуется сложная пробоподготовка или экстракция.
- Возможность анализа летучих компонентов.
- Возможность разделения компонентов смеси.
- Чтобы иметь возможность идентифицировать обнаруженные компоненты.
- Способность предоставлять полу количественное и потенциально количественное представление об обнаруженных компонентах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование контрольных образцов, как экологических контрольных образцов, созданных во время отбора проб, так и системных заготовок, имеет решающее значение для интерпретации образцов с запаховым метками. Любые пики, приписываемые среде выборки или инструментальной системе, должны…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Keith Holding за его помощь в химическом анализе в Научном центре Розалинд Франклин, Вулверхэмптон, и Бена Мантла за производство видео. Мы также благодарны профессору Глориано Монети, доктору Джузеппе Пьераччини и членам Центра масс-спектрометрии Университета Флоренции во Флоренции, а также профессору Луке Каламаю и доктору Марко Микелоцци из лаборатории ARCA CNR, Флоренция, за их помощь в создании этой методологии. Исследовательские проекты, которые включали методы отбора проб и анализа, описанные в рукописи, были поддержаны двумя внутриевропейскими стипендиями Марии Склодовской-Кюри (идентификаторы грантового соглашения: 327083, 703611), небольшим грантом(«Сенсорно обогащенный примат»)от Общества приматов Великобритании и небольшим исследовательским грантом(«Имеют ли охотники-собиратели особое обоняние?»)от Британской академии / The Leverhulme Trust для S.V. Лабораторные работы, необходимые для создания этой методологии, также получили финансирование от Ежегодного конкурса финансирования факультета науки и техники (Вулверхэмптон) для S.V.
Materials
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | – | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | – | Excel |
| Spectral library | NIST | – | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | – | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
- Wyatt, T. D. . Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , (2014).
- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
- Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The “secret” in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
- Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
- Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
- Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
- Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
- Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
- Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
- Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
- Pawliszyn, J. . Solid phase microextraction: theory and practice. , (1997).
- Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951 (2019).
