Scheiding van bioactieve kleine moleculen, peptiden uit natuurlijke bronnen en eiwitten uit microben door preparative isoelectric Focus (IEF) Methode
Summary
Het doel is om bioactieve kleine moleculen, peptiden uit een complex plantenextract en eiwitten uit pathogene microben te fractioneren en te isoleren door gebruik te maken van de isoelectrische focusmethode (IEF) met vloeibare fase. Verder werden de gescheiden moleculen geïdentificeerd en hun bioactiviteit bevestigd.
Abstract
Natuurlijke producten afkomstig van planten en microben zijn een rijke bron van bioactieve moleculen. Voorafgaand aan het gebruik ervan moeten de actieve moleculen uit complexe extracten worden gezuiverd voor downstreamtoepassingen. Er zijn verschillende chromatografische methoden beschikbaar voor dit doel, maar niet alle laboratoria kunnen zich veroorloven high performance methoden en isolatie van complexe biologische monsters kan moeilijk zijn. Hier tonen we aan dat preparatieve vloeibare fase isoelectrische scherpstelling (IEF) moleculen, waaronder kleine moleculen en peptiden uit complexe plantenextracten, kan scheiden op basis van hun isoelectric points (pI). We hebben de methode gebruikt voor complexe biologische monsterfractionering en karakterisering. Als bewijs van concept, hebben we gefractioneerd een Gymnema sylvestre plantenextract, het isoleren van een familie van terpenoïde saponine kleine moleculen en een peptide. We hebben ook aangetoond effectieve microbiële eiwitscheiding met behulp van de Candida albicans schimmel als een model systeem.
Introduction
De zuivering van biomoleculen uit complexe biologische monsters is een essentiële en vaak moeilijke stap in biologische experimenten1. Isoelectric focus (IEF) is zeer geschikt voor hoge resolutie scheiding van complexe biomoleculen waar drager ampholyten reizen volgens hun lading en de pH gradiënt vast te stellen in een elektrisch veld3. De eerste commerciële carrier ampholyte voor IEF werd ontwikkeld door Olof Vesterberg in 1964 en gepatenteerd4,5. Carrier ampholyten zijn aliphatic oligo-amino oligo-carboxylzuur moleculen van verschillende lengte en vertakking6. Vervolgens verbeterden Vesterberg en anderen de drageramorholyten voor hun uitgebreide gebruik bij het scheiden van biomoleculen6,7.
Methoden om biomoleculen te scheiden omvatten agarose en polyacrylamide gel elektroforese, tweedimensionale gel elektroforese (2-DE), isoelectrische scherpstelling, capillaire elektroforese, isotachophoresis en andere chromatografische technieken (bijvoorbeeld TLC, FPLC, HPLC)2. Vloeibare fase IEF uitgevoerd in een instrument genaamd een “Rotofor” werd uitgevonden door Milan Bier8. Hij was pionier in het concept en ontwerp van dit instrument en droeg uitgebreid bij aan de theorie van elektroforetische migratie. Zijn team ontwikkelde ook een wiskundig model van elektroforetisch scheidingsproces voor computersimulaties9.
Het IEF-apparaat met vloeibare fase is een horizontaal roterende cilindrische cel bestaande uit een nylon kern verdeeld in 20 poreuze compartimenten en een circulerende waterkoelende keramische staaf. De poreuze kamers laten moleculen toe om door de waterige fase tussen de elektroden te migreren en het verzamelen van gezuiverde monsters onder vacuüm in fracties mogelijk te maken. Dit zuiveringssysteem kan tot 1000-voudige zuivering van een specifiek molecuul in <4 uur verstrekken. Een waardevol kenmerk van dit instrument is dat het kan worden toegepast als een eerste stap voor zuivering van een complex mengsel of als een laatste stap om zuiverheid te bereiken10. Als het molecuul van belang is een eiwit, een ander voordeel is dat de inheemse conformatie zal worden gehandhaafd tijdens de scheiding.
Het gebruik van vloeibare fase IEF is op grote schaal gemeld voor eiwitten, enzymen en antilichaamzuivering6,10,11,12,13,14. Hier beschrijven we het gebruik van deze aanpak voor het scheiden en zuiveren van kleine moleculen en peptiden van de medicinale plant Gymnema sylvestre. Dit protocol zal onderzoekers helpen zich te concentreren en te zuiveren actieve kleine moleculen uit een plantenextract voor downstream-toepassingen tegen lage kosten. Daarnaast tonen we ook aan dat verrijking van eiwitten uit een complex eiwitextract uit Candida albicans schimmel15 in dit IEF-gebaseerde systeem als tweede voorbeeld.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kleine moleculen uit natuurlijke productbronnen (bijvoorbeeld planten) bevatten complexe secundaire metabolieten die zeer divers zijn in chemische structuur. Ze worden verondersteld te worden betrokken bij de afweermechanismen van planten. Daarnaast zijn polypeptiden ook aanwezig in plantenweefsels22. Deze natuurlijke product kleine moleculen zijn rijke bronnen van testmoleculen voor drug ontdekking en ontwikkeling. Echter, de moeilijke en vervelende methoden die nodig zijn voor hun isolatie en zu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor de financiering bronnen van de afdeling Biologie en Johnson Cancer Research Center voor BRIEF en IRA awards, respectievelijk aan GV. We danken ook de K-INBRE postdoctorale award aan RV. Dit werk werd mede ondersteund door de Institutional Development Award (IDeA) van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder subsidienummer P20 GM103418. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van het National Institute of General Medical Sciences of de National Institutes of Health. Wij danken de anonieme reviewers voor hun nuttige opmerkingen.
Materials
| 0.45 µm syringe filter | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Compact low temperature thermostat | Lauda -Brinkmann | RM 6T | Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Dialysis tubing (3,500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids) | Suan Farma, NJ USA | ||
| Incubator | Lab companion | SI 300R | |
| Microscope | Leica | DM 6B | |
| Mini protean electrophoresis | Bio-Rad | ||
| pH meter | Mettler Toledo | S20 | Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Sealing tape | Bio-Rad | 170-2960 | Scotch tape may also be used. |
| Sorvall legend micro 17 centrifuge | Thermo scientific | 75002432 | |
| TPP tissue culture plate -96 well flat bottom | TPP | TP92696 |
References
- Jankowska, U., et al. Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain. Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).
- Pergande, M. R., Cologna, S. M. Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins. Proteomes. 5 (1), (2017).
- Stoyanov, A. IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution. Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).
- Vesterberg, O. A. Y. . Method of Isoelectric Fractionation. , (1964).
- Vesterberg, O., Svensson, H. Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins. Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).
- Righetti, P. G. . Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. , 1 (1983).
- Vesterberg, O. Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes. Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).
- Bier, M. Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis. Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).
- Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation. Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).
- Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure. Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).
- Wagner, L., et al. Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization. Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).
- Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing. Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).
- Yu, J. J., et al. Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice. Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).
- Riyong, D., et al. Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).
- Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins. Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).
- Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d’Enfert, C. Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans. PLoS One. 8 (9), 74189 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides. Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).
- Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre. Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).
- Craik, D. J. Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends. Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).
- Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif. Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).
- Stoecklin, W. Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).
- Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).
- Veerapandian, R., Vediyappan, G. Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms. Frontiers in Microbiology. 10, 2328 (2019).
- Chaffin, W. L. Candida albicans cell wall proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).
