Separazione delle piccole molecole bioattive, Peptidi da fonti naturali e proteine dai microbi di Preparative Isoelectric Focusing (IEF) Metodo
Summary
L’obiettivo è frazionare e isolare piccole molecole bioattive, peptidi da un complesso estratto vegetale e proteine da microbi patogeni utilizzando il metodo di messa a fuoco isoelettrica a fase liquida (IEF). Inoltre, sono state identificate le molecole separate e la loro bioattività è stata confermata.
Abstract
I prodotti naturali derivati da piante e microbi sono una ricca fonte di molecole bioattive. Prima del loro utilizzo, le molecole attive da estratti complessi devono essere purificate per applicazioni a valle. Ci sono vari metodi cromatografici disponibili per questo scopo, ma non tutti i laboratori possono permettersi metodi ad alte prestazioni e l’isolamento da campioni biologici complessi può essere difficile. Qui dimostriamo che la messa a fuoco isoelettrica in fase liquida preparata (IEF) può separare le molecole, tra cui piccole molecole e peptidi da complessi estratti vegetali, in base ai loro punti isoelettrici (pI). Abbiamo usato il metodo per la frazionamento e la caratterizzazione complesse dei campioni biologici. Come prova di concetto, abbiamo frazionato un estratto di pianta di Gymnema sylvestre, isolando una famiglia di salonina terpenoide piccole molecole e un peptide. Abbiamo anche dimostrato un’efficace separazione delle proteine microbiche usando il fungo Candida albicans come sistema modello.
Introduction
La purificazione delle biomolecole da complessi campioni biologici è un passo essenziale e spesso difficile negli esperimenti biologici1. La messa a fuoco isoelettrica (IEF) è adatta per la separazione ad alta risoluzione di biomolecole complesse in cui gli amplificatori portante viaggiano secondo la loro carica e stabiliscono il gradiente di pH in un campo elettrico3. Il primo amplificatore commerciale per IEF è stato sviluppato da Olof Vesterberg nel 1964 e brevettato4,5. Gli ampifiti portatrici sono molecole di acido oligo-amino-amino-carboxylicia alatoriche a varia lunghezza e ramificazione6. Successivamente, Vesterberg e altri migliorarono gli amplificatori del vettore per il loro uso espanso nel separare le biomolecole6,7.
I metodi per separare le biomolecole includono l’elettroforesi gel agarosa e poliacrilamina, l’elettroforesi gel bidimensionale (2-DE), la messa a fuoco isoelettrica, l’elettroforesi capillare, l’isotachophoresi e altre tecniche cromografiche (ad esempio, TLC, FPLC, HPLC)2. La IEF in fase liquida eseguita in uno strumento chiamato “Rotofor” è stata inventata da Milan Bier8. Fu pioniere nel concetto e nella progettazione di questo strumento e contribuì ampiamente alla teoria della migrazione elettroforetica. Il suo team ha anche sviluppato un modello matematico del processo di separazione elettroforetica per simulazioni al computer9.
L’apparato IEF a fase liquida è una cella cilindrica a rotazione orizzontale costituita da un nucleo di nylon diviso in 20 compartimenti porosi e un’asta di ceramica di raffreddamento ad acqua circolante. Le camere porose permettono alle molecole di migrare attraverso la fase acquosa tra gli elettrodi e permettono la raccolta di campioni purificati sotto vuoto in frazioni. Questo sistema di purificazione può fornire fino a 1000 volte la purificazione di una molecola specifica in <4 ore. Una caratteristica preziosa di questo strumento è che può essere applicato come primo passo per la purificazione da una miscela complessa o come passo finale per raggiungere la purezza10. Se la molecola di interesse è una proteina, un altro vantaggio è che la sua conformazione nativa sarà mantenuta durante la separazione.
L’uso di IEF a fase liquida è stato ampiamente segnalato per proteine, enzimi e purificazione degli anticorpi6,10,11,12,,13,14. Qui descriviamo l’uso di questo approccio per separare e purificare piccole molecole e peptidi dalla pianta medicinale Gymnema sylvestre. Questo protocollo aiuterà i ricercatori a concentrato e a purificare le piccole molecole attive da un estratto di pianta per applicazioni a valle a basso costo. Inoltre, dimostriamo anche che l’arricchimento delle proteine da un complesso estratto di proteine da Candida albicans fungo15 in questo sistema basato su IEF come secondo esempio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le piccole molecole provenienti da fonti di prodotti naturali (ad esempio, piante) includono metaboliti secondari complessi che sono altamente diversificati nella struttura chimica. Si ritiene che siano coinvolti nei meccanismi di difesa delle piante. Inoltre, i polipeptidi sono presenti anche nei tessuti vegetali22. Questi piccoli molecole di prodotto naturale sono ricche fonti di molecole di prova per la scoperta e lo sviluppo di farmaci. Tuttavia, i metodi difficili e noiosi necessari per il lo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati per le fonti di finanziamento della Divisionof Biology e Johnson Cancer Research Center per i premi BRIEF e IRA, rispettivamente a GV. Ringraziamo anche il premio post-dottorato K-INBRE al camper. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dall’Institutional Development Award (IDeA) dell’Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Sanità con il numero di sovvenzione P20 GM103418. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dell’Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali o degli Istituti Nazionali di Sanità. Ringraziamo i revisori anonimi per i loro commenti utili.
Materials
| 0.45 µm syringe filter | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Compact low temperature thermostat | Lauda -Brinkmann | RM 6T | Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Dialysis tubing (3,500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids) | Suan Farma, NJ USA | ||
| Incubator | Lab companion | SI 300R | |
| Microscope | Leica | DM 6B | |
| Mini protean electrophoresis | Bio-Rad | ||
| pH meter | Mettler Toledo | S20 | Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Sealing tape | Bio-Rad | 170-2960 | Scotch tape may also be used. |
| Sorvall legend micro 17 centrifuge | Thermo scientific | 75002432 | |
| TPP tissue culture plate -96 well flat bottom | TPP | TP92696 |
References
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