생리 활성 소분자의 분리, 천연 공급원에서 펩티드 및 미생물에서 단백질(Preparative IEF) 방법에 의한
Summary
목표는 액체 상 이소전 초점 (IEF) 방법을 채택하여 생리 활성 소분자, 복잡한 식물 추출물에서 펩티드 및 병원성 미생물의 단백질을 분수하고 분리하는 것입니다. 또한, 분리된 분자가 확인되었고 그들의 생체 활성이 확인되었다.
Abstract
식물과 미생물에서 파생 된 천연 제품은 생리 활성 분자의 풍부한 소스입니다. 사용하기 전에 복잡한 추출물의 활성 분자는 다운스트림 응용 제품에 대해 정제되어야 합니다. 이러한 목적을 위해 사용할 수 있는 다양한 크로마토그래피 방법이 있지만 모든 실험실이 고성능 방법을 감당할 수 있는 것은 아니며 복잡한 생물학적 샘플로부터의 격리가 어려울 수 있다. 여기서 우리는 전두엽 액체 상 등소 초점 (IEF)이 그들의 동전 점 (pI)에 따라 복잡한 식물 추출물에서 작은 분자 및 펩티드를 포함하여 분자를 분리 할 수 있음을 보여줍니다. 우리는 복잡한 생물학적 샘플 분별 및 특성화를 위한 방법을 사용했습니다. 개념의 증거로, 우리는 체메마 실베스트레 식물 추출물을 분획하여 테르페노이드 사포닌 소분자와 펩타이드 가족을 격리시켰습니다. 우리는 또한 모델 시스템으로 칸디다 알비칸스 균구를 사용하여 효과적인 미생물 단백질 분리를 시연했습니다.
Introduction
복잡한 생물학적 샘플로부터의 생체 분자의 정제는 생물학적 실험1에서필수적이고 종종 어려운 단계이다. 동전 적 초점 (IEF)은 캐리어 앰프가 자신의 전하에 여행하고 전기 필드3에서pH 그라데이션을 설정하는 복잡한 생체 분자의 고해상도 분리에 적합합니다. IEF를 위한 최초의 상용 캐리어 앰프는 1964년 올로프 베스터버그에 의해 개발되었으며4,5의5특허를 받았습니다. 담체 앰플은 다양한 길이와 분지6의알리팔 올리고-아미노 올리고 카복실산 분자이다. 그 후, 베스터버그 와 그 외는 생체 분자를분리하는 확장된 사용을 위해 담체 앰프를6,7로개선하였다.
생체분자를 분리하는 방법에는 아가로즈 및 다환핵증 겔 전기포레시스, 2차원 겔 전기포전증(2-DE), 이소전 초점, 모세관 전기포리스, 이소타초포레시스 및 기타 크로마토그래피 기술(예를 들어, TLC, FPLC, HPLC)2를포함한다. “로토포”라는 기기에서 수행된 액체 상 IEF는 밀라노 비어8에의해 발명되었다. 그는 이 기기의 개념과 디자인을 개척했으며 전기 전구 이동 이론에 광범위하게 기여했습니다. 그의 팀은 또한 컴퓨터 시뮬레이션9에대한 전기 전구 분리 프로세스의 수학적 모델을 개발했다.
상기 액상 IEF 장치는 20개의 다공성 구획과 순환수 냉각 세라믹 로드로 나일론 코어로 구성된 수평 회전 원통형 세포이다. 다공성 챔버는 분자가 전극 사이의 수성 단계를 통해 마이그레이션하고 분획에서 진공 상태에서 정제 된 시료의 수집을 허용합니다. 이 정제 시스템은 &4 시간 에서 특정 분자의 최대 1000 배 정제를 제공 할 수 있습니다. 이 악기의 귀중한 특징은 복잡한 혼합물에서 정화를 위한 첫 번째 단계로 또는순도(10)를달성하기 위한 최종 단계로 적용될 수 있다는 것이다. 관심있는 분자가 단백질인 경우, 또 다른 장점은 분리 중에 그것의 토착 형성이 유지될 것이라는 점입니다.
액체상 IEF의 사용은 단백질, 효소 및 항체 정화6,,10,,11,,,12,13,,14에대해 널리 보고되었다. 여기서 우리는 약용 식물 Gymnema sylvestre에서작은 분자와 펩티드를 분리하고 정화하기위한이 접근 법의 사용을 설명합니다. 이 프로토콜은 연구원이 낮은 비용으로 다운스트림 응용 프로그램을 위해 식물 추출물에서 활성 소분자를 집중하고 정화하는 데 도움이 될 것입니다. 또한, 우리는 또한 칸디다 알비칸스 균류(15)로부터 의 복잡한 단백질 추출물로부터 단백질의 농축이 두 번째 예로 이 IEF 기반 시스템에서 있음을 입증합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
천연 제품 소스에서 작은 분자 (예를 들어, 식물) 화학 구조에서 매우 다양 한 복잡 한 이차 대사 산물을 포함. 그들은 식물 방어 메커니즘에 관여하는 것으로 추정된다. 또한, 폴리펩타이드는 식물조직(22)에도존재한다. 이러한 천연 제품 작은 분자는 약물 발견 및 개발을 위한 테스트 분자의 풍부한 소스. 그러나, 그들의 격리 및 정화에 필요한 어렵고 지루한 방법은 치료 응용 프…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 GV에 각각, BRIEF와 IRA 상을위한 생물학과 존슨 암 연구 센터의 자금 출처에 감사드립니다. 또한 RV에 대한 K-INBRE 박사 후 상을 수상해 주셔서 감사합니다. 이 작품은 보조금 번호 P20 GM103418에서 건강의 국립 연구소의 국립 일반 의학 연구소에서 기관 개발 상 (IDeA)에 의해 부분적으로 지원되었다. 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 일반 의학 연구소 또는 국립 보건 원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 익명의 검토자에게 유용한 의견을 전해 주셔서 감사합니다.
Materials
| 0.45 µm syringe filter | Fisher scientfic | 09-720-004 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Ammonium carbonate | Sigma-Aldrich | 207861-500 | |
| Bio-Lyte 3/10 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1113 | |
| Bio-Lyte 5/8 Ampholyte | Bio-Rad | 163-1192 | |
| Compact low temperature thermostat | Lauda -Brinkmann | RM 6T | Set water cooling to 4 oC and it can be run even at 0 oC as when it passes through the Rotofor cooling core, the circulating water temperature will be around 5 or more depending on the voltage. |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| Dialysis tubing (3,500 MWCO) | Spectrum Spectra/Por | 132112T | |
| Gymnema plant leaf extract powder (>25% Gymnemic acids) | Suan Farma, NJ USA | ||
| Incubator | Lab companion | SI 300R | |
| Microscope | Leica | DM 6B | |
| Mini protean electrophoresis | Bio-Rad | ||
| pH meter | Mettler Toledo | S20 | Useful to determine the pH of the Rotofor (liquid-phase IEF) fractions |
| Rotofor | Bio-Rad | 170-2972 | http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instruction manual for assembling the unit) |
| RPMI-1640 Medium | HyClone | DH30255.01 | |
| Sealing tape | Bio-Rad | 170-2960 | Scotch tape may also be used. |
| Sorvall legend micro 17 centrifuge | Thermo scientific | 75002432 | |
| TPP tissue culture plate -96 well flat bottom | TPP | TP92696 |
References
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