Geleide differentiatie van rijpe nierpodocyten uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen onder chemisch gedefinieerde omstandigheden
Summary
Hier wordt een chemisch gedefinieerd protocol gepresenteerd voor de afleiding van menselijke nierpodocyten uit geïnduceerde pluripotente stamcellen met een hoge efficiëntie (>90%) en onafhankelijk van genetische manipulaties of subpopulatieselectie. Dit protocol produceert het gewenste celtype binnen 26 dagen en kan nuttig zijn voor nefrotoxiciteitstests en ziektemodellering.
Abstract
Nierziekte treft meer dan 10% van de wereldbevolking en kost miljarden dollars aan federale uitgaven. De meest ernstige vormen van nierziekte en uiteindelijk eindstadium nierfalen worden vaak veroorzaakt door de schade aan de glomerulaire podocyten, de zeer gespecialiseerde epitheelcellen die samen met endotheelcellen en het glomerulaire keldermembraan functioneren om de filtratiebarrière van de nier te vormen. Vooruitgang in de niergeneeskunde is gehinderd door de beperkte beschikbaarheid van primaire weefsels en het gebrek aan robuuste methoden voor de afleiding van functionele menselijke niercellen, zoals podocyten. Het vermogen om podocyten af te leiden uit hernieuwbare bronnen, zoals stamcellen, kan helpen het huidige begrip van de mechanismen van menselijke nierontwikkeling en -ziekte te bevorderen, en nieuwe hulpmiddelen bieden voor therapeutische ontdekking. Het doel van dit protocol was om een methode te ontwikkelen om volwassen, post-mitotische podocyten af te leiden uit door de mens geïnduceerde pluripotente stam (hiPS) cellen met een hoge efficiëntie en specificiteit, en onder chemisch gedefinieerde omstandigheden. De van hiPS-cellen afgeleide podocyten die door deze methode worden geproduceerd, drukken afstammingsspecifieke markers uit (waaronder nefrine, podocine en Wilm’s Tumor 1) en vertonen de gespecialiseerde morfologische kenmerken (inclusief primaire en secundaire voetprocessen) geassocieerd met volwassen en functionele podocyten. Intrigerend genoeg zijn deze gespecialiseerde kenmerken met name afwezig in de onsterfelijke podocytencellijn die veel in het veld wordt gebruikt, wat suggereert dat het hierin beschreven protocol menselijke nierpodocyten produceert die een ontwikkelingsrijp fenotype hebben dan de bestaande podocytcellijnen die meestal worden gebruikt om de menselijke nierbiologie te bestuderen.
Introduction
Vooruitgang in menselijke pluripotente stamcelcultuur staat klaar om een revolutie teweeg te brengen in regeneratieve geneeskunde, ziektemodellering en medicijnscreening door onderzoekers een hernieuwbare, schaalbare bron van biologisch materiaal te bieden die kan worden ontworpen om bijna elk celtype in het menselijk lichaam te verkrijgen1. Deze strategie is vooral nuttig voor het afleiden van gespecialiseerde en functionele celtypen die anders moeilijk te verkrijgen zouden zijn. Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPS)2,3,4,5 zijn bijzonder aantrekkelijk vanwege hun somatische celoorsprong en het potentieel dat ze vertegenwoordigen voor gepersonaliseerde geneeskunde. Het ontwikkelen van methoden om andere cellijningen af te leiden uit hiPS-cellen blijft echter een uitdaging vanwege het frequente gebruik van slecht gedefinieerde kweekomstandigheden die leiden tot een lage efficiëntie en niet-specifieke generatie van heterogene celpopulaties6,7.
Hier gepresenteerd is een methode voor de afleiding van volwassen nierpodocyten uit hiPS-cellen met specificiteit en hoge efficiëntie onder chemisch gedefinieerde omstandigheden. Door rekening te houden met de rol van meerdere factoren binnen de cellulaire micro-omgeving, werd een stamceldifferentiatiestrategie ontwikkeld die de optimalisatie van oplosbare factoren in het celkweekmedium omvatte, evenals onoplosbare factoren, zoals extracellulaire matrixcomponenten of kleefsubstraten. Gezien het belang van integrinesignalering in de ontwikkeling en functie van podocyten, werd de expressie van integrinereceptoren op het celoppervlak aanvankelijk onderzocht. β1-integrinen kwamen niet alleen sterk tot expressie in hiPS-cellen, maar ook in hun derivaten, waaronder mesoderm- en intermediaire mesodermcellen8,9,10. Latere experimenten bevestigden dat liganden die binden aan β1-integrinen (inclusief laminine 511 of laminine 511-E8-fragment) de hechting en differentiatie van hiPS-cellen in podocyten ondersteunen bij gebruik in combinatie met de oplosbare inductieve media die hieronder worden beschreven.
Inductie van cellijn commitment werd geïnitieerd door eerst te bevestigen dat hiPS-cellen gekweekt op de laminine-gecoate oppervlakken gedurende twee dagen in aanwezigheid van een medium met Activine A, CHIR99021 en Y27632 Rock-remmer kunnen differentiëren in cellen die de vroege mesodermmarkers HAND1, goosecoid en brachyury tot expressie brengen8,11. Behandeling van de mesodermcellen gedurende 14 dagen met een medium aangevuld met botmorfogenetisch eiwit 7 (BMP-7) en CHIR99021 maakte de afleiding mogelijk van intermediaire mesodermcellen die de nefron-voorlopercelmarkers Wilm’s Tumor 1 (WT1), oneven overgeslagen gerelateerd eiwit 1 (OSR1)8,11en gepaard box gen 2-eiwit (PAX2)12tot expressie riepen. Om de rijpe nierglomerulaire podocyten af te leiden, werden de intermediaire mesodermcellen gedurende 4-5 dagen behandeld met een nieuw medium bestaande uit BMP-7, Activine A, vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF), transtrans-retinoïnezuur en CHIR99021. Flowcytometrie en immunostaining werden gebruikt om te bevestigen dat >90% van de resulterende cellen de moleculaire, morfologische en functionele kenmerken van de volwassen nierpodocyt8,11,13vertoonden. Deze kenmerken omvatten de ontwikkeling van primaire en secundaire voetprocessen; de expressie van podocytenlijnspecifieke genen, waaronder SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 en de expressie van eiwitten waaronder podocine, nefrine en WT114,15,16. Bovendien bleek dat de van hiPS-cellen afgeleide podocyten tot vier weken in vitro in cultuur kunnen worden gehouden door een commercieel beschikbaar medium8,11 te gebruiken dat een extra flexibiliteit biedt in de timing van downstream-experimenten. Voor meer informatie over de flowcytometriepanelen die worden gebruikt voor het bepalen van de zuiverheid van de hiPS-podocyten, verwijzen wij u naar onze vorige publicatie11.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit rapport beschrijven we een protocol voor het genereren van nierglomerulaire podocyten uit hiPS-cellen. De van hiPS-cellen afgeleide podocyten vertonen morfologische en moleculaire kenmerken geassocieerd met het volwassen nierpodocytenfenotype13. In eerdere publicaties toonden we aan dat de van hiPS-cellen afgeleide podocyten de structuur en selectieve filtratiefunctie van de nierglomerulus kunnen nabootsen wanneer ze worden gekweekt met glomerulaire microvasculaire endotheelcellen in een pe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Pratt School of Engineering aan de Duke University, de afdeling Nefrologie aan de Duke Medical School, A Chair’s Research Award van de afdeling Geneeskunde aan de Duke University en een Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award aan S.M.. M.B werd ondersteund door het Graduate Research Fellowship Program van de National Science Foundation. We bedanken het Bursac Lab voor het genereus verstrekken van de DU11-stamcellijn en het Varghese Lab aan de Duke University voor het tijdelijk delen van hun weefselkweekfaciliteit met onze groep. Deze publicatie is opgedragen aan Prof. Laura L. Kiessling, Novartis Professor of Chemistry aan het Massachusetts Institute of Technology, ter ere van haar 60e verjaardag.
Materials
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T） | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
- Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. 发育生物学. 316, 288-301 (2008).
- Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. 发育生物学. 313, 584-593 (2008).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
- Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
- Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
- Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
- Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
- Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Clevers, H., Nusse, R. Wntβ-Catenin Signaling and Disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
- Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
- Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
- Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
- Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).
