Geführte Differenzierung reifer Nierenpodozyten aus human induzierten pluripotenten Stammzellen unter chemisch definierten Bedingungen
Summary
Hier wird ein chemisch definiertes Protokoll zur Ableitung menschlicher Nierenpodozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen mit hoher Effizienz (>90%) und unabhängig von genetischen Manipulationen oder Subpopulationsselektion vorgestellt. Dieses Protokoll erzeugt den gewünschten Zelltyp innerhalb von 26 Tagen und könnte für Nephrotoxizitätstests und Krankheitsmodellierung nützlich sein.
Abstract
Nierenerkrankungen betreffen mehr als 10% der Weltbevölkerung und kosten Milliarden von Dollar an Bundesausgaben. Die schwersten Formen der Nierenerkrankung und das eventuelle Nierenversagen im Endstadium werden oft durch die Schädigung der glomerulären Podozyten verursacht, bei denen es sich um die hochspezialisierten Epithelzellen handelt, die zusammen mit Endothelzellen und der glomerulären Basalmembran die Filtrationsbarriere der Niere bilden. Fortschritte in der Nierenmedizin wurden durch die begrenzte Verfügbarkeit von Primärgewebe und das Fehlen robuster Methoden zur Ableitung funktioneller menschlicher Nierenzellen wie Podozyten behindert. Die Fähigkeit, Podozyten aus erneuerbaren Quellen wie Stammzellen abzuleiten, könnte dazu beitragen, das aktuelle Verständnis der Mechanismen der menschlichen Nierenentwicklung und -krankheit zu verbessern und neue Werkzeuge für die therapeutische Entdeckung bereitzustellen. Ziel dieses Protokolls war es, eine Methode zu entwickeln, um reife, postmiotische Podozyten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS) mit hoher Effizienz und Spezifität und unter chemisch definierten Bedingungen abzuleiten. Die mit dieser Methode produzierten hiPS-Zell-abgeleiteten Podozyten exprimieren linienspezifische Marker (einschließlich Nephrin, Podocin und Wilm-Tumor 1) und weisen die spezialisierten morphologischen Merkmale (einschließlich primärer und sekundärer Fußprozesse) auf, die mit reifen und funktionellen Podozyten verbunden sind. Interessanterweise fehlen diese spezialisierten Merkmale in der immortalisierten Podozytenzelllinie, die in diesem Bereich weit verbreitet ist, was darauf hindeutet, dass das hier beschriebene Protokoll menschliche Nierenpodozyten produziert, die einen entwicklungsreiferen Phänotyp aufweisen als die bestehenden Podozytenzelllinien, die typischerweise zur Untersuchung der menschlichen Nierenbiologie verwendet werden.
Introduction
Fortschritte in der humanen pluripotenten Stammzellkultur sind bereit, die regenerative Medizin, die Krankheitsmodellierung und das Drogenscreening zu revolutionieren, indem sie Forschern eine erneuerbare, skalierbare Quelle für biologisches Material zur Verfügung stellen, die entwickelt werden kann, um fast jeden Zelltyp im menschlichen Körper zu erhalten1. Diese Strategie ist besonders nützlich, um spezialisierte und funktionelle Zelltypen abzuleiten, die sonst schwer zu erhalten wären. Human induced pluripotent stem (hiPS) Zellen2,3,4,5 sind aufgrund ihrer somatischen Zellursprung und des Potenzials, das sie für die personalisierte Medizin darstellen, besonders attraktiv. Die Entwicklung von Methoden zur Ableitung anderer Zelllinien aus hiPS-Zellen bleibt jedoch aufgrund der häufigen Verwendung schlecht definierter Kulturbedingungen, die zu einer geringen Effizienz und unspezifischen Erzeugung heterogener Zellpopulationenführen,eine Herausforderung6,7.
Hier wird eine Methode zur Ableitung reifer Nierenpodozyten aus hiPS-Zellen mit Spezifität und hoher Effizienz unter chemisch definierten Bedingungen vorgestellt. Unter Berücksichtigung der Rolle mehrerer Faktoren innerhalb der zellulären Mikroumgebung wurde eine Stammzelldifferenzierungsstrategie entwickelt, die die Optimierung löslicher Faktoren im Zellkulturmedium sowie unlöslicher Faktoren wie extrazelluläre Matrixkomponenten oder adhäsive Substrate beinhaltete. Angesichts der Bedeutung der Integrinsignalisierung für die Entwicklung und Funktion von Podozyten wurde zunächst die Expression von Integrinrezeptoren auf der Zelloberfläche untersucht. β1-Integrine wurden nicht nur in hiPS-Zellen, sondern auch in ihren Derivaten einschließlich Mesoderm- und Intermesodermzellen stark exprimiert8,9,10. Nachfolgende Experimente bestätigten, dass Liganden, die an β1-Integrine binden (einschließlich Laminin 511 oder Laminin 511-E8-Fragment), die Adhäsion und Differenzierung von hiPS-Zellen in Podozyten unterstützen, wenn sie in Verbindung mit den unten beschriebenen löslichen induktiven Medien verwendet werden.
Die Induktion der Zelllinienverpflichtung wurde eingeleitet, indem zunächst bestätigt wurde, dass hiPS-Zellen, die zwei Tage lang auf den lamininbeschichteten Oberflächen in Gegenwart eines Mediums kultiviert wurden, das Activin A, CHIR99021 und Y27632 Rock-Inhibitor enthält, sich in Zellen differenzieren können, die die frühen Mesodermmarker HAND1, Goosecoid und Brachyury8,11exprimieren. Die Behandlung der Mesodermzellen für 14 Tage mit einem Medium, das mit Knochenmorphogenetikprotein 7 (BMP-7) und CHIR99021 ergänzt wurde, ermöglichte die Ableitung von intermediären Mesodermzellen, die die Nephron-Vorläuferzellmarker Wilms Tumor 1 (WT1), odd-skipped related protein 1 (OSR1)8,11und paired box gene 2 protein (PAX2)12exprimierten. Um die reifen glomerulären Nierenpodozyten abzuleiten, wurden die intermediären Mesodermzellen 4–5 Tage lang mit einem neuartigen Medium behandelt, das aus BMP-7, Activin A, vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF),All-trans-Retinsäure und CHIR99021 besteht. Durchflusszytometrie und Immunfärbung wurden verwendet, um zu bestätigen, dass >90% der resultierenden Zellen die molekularen, morphologischen und funktionellen Eigenschaften des reifen Nierenpodozytenaufwiesen 8,11,13. Zu diesen Eigenschaften gehören die Entwicklung von primären und sekundären Fußprozessen; die Expression von Podozytenlinien-spezifischen Genen einschließlich SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 und die Expression von Proteinen wie Podocin, Nephrin und WT114,15,16. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die von hiPS-Zellen abgeleiteten Podozyten bis zu vier Wochen in vitro in Kultur gehalten werdenkönnen,indem ein kommerziell erhältliches Medium8,11 verwendet wird, das eine zusätzliche Flexibilität beim Timing nachgeschalteter Experimente bietet. Weitere Informationen zu den Durchflusszytometrie-Panels, die zur Bestimmung der Reinheit der hiPS-Podozyten verwendet werden, finden Sie in unserer vorherigen Publikation11.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Bericht beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von glomerulären Nierenpodozyten aus hiPS-Zellen. Die von hiPS-Zellen abgeleiteten Podozyten weisen morphologische und molekulare Merkmale auf, die mit dem reifen Nierenpodozytenphänotyp13assoziiert sind. In früheren Veröffentlichungen haben wir gezeigt, dass die von hiPS-Zellen abgeleiteten Podozyten die Struktur und selektive Filtrationsfunktion des Nierenglomerulus nachahmen können, wenn sie mit glomerulären mikrovaskulären En…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Pratt School of Engineering an der Duke University, der Division of Nephrology an der Duke Medical School, dem A Chair’s Research Award des Department of Medicine der Duke University und einem Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award an S.M unterstützt. M.B wurde durch das Graduate Research Fellowship Program der National Science Foundation unterstützt. Wir danken dem Bursac Lab für die großzügige Bereitstellung der DU11-Stammzelllinie und dem Varghese Lab an der Duke University für die vorübergehende Freigabe ihrer Gewebekultureinrichtung mit unserer Gruppe. Diese Publikation ist Prof. Laura L. Kiessling, Novartis Professorin für Chemie am Massachusetts Institute of Technology, anlässlich ihres 60.Geburtstages gewidmet.
Materials
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T） | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
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