Olgun Böbrek Podositlerinin Kimyasal Olarak Tanımlanmış Koşullar Altında İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Rehberli Farklılaşması
Summary
Burada sunulan, insan böbrek podositlerinin yüksek verimli (%>90) ve genetik manipülasyonlardan veya alt popülasyon seçiminden bağımsız olarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetülmesi için kimyasal olarak tanımlanmış bir protokoldür. Bu protokol 26 gün içinde istenen hücre tipini üretir ve nefrotoksisite testi ve hastalık modellemesi için yararlı olabilir.
Abstract
Böbrek hastalığı küresel nüfusun % 10’undan fazlasını etkiler ve federal harcamalarda milyarlarca dolara mal olur. Böbrek hastalığının en şiddetli formları ve nihai son aşama böbrek yetmezliği, genellikle endotel hücreleri ve böbreğin filtrasyon bariyerini oluşturmak için glomerüler bodrum zarı ile birlikte çalışan son derece uzmanlaşmış epitel hücreleri olan glomerüler podositlerin hasar görmesinden kaynaklanır. Böbrek tıbbındaki gelişmeler, birincil dokuların sınırlı mevcudiyeti ve podositler gibi fonksiyonel insan böbrek hücrelerinin türemesi için sağlam yöntemlerin bulunmaması nedeniyle engellenmiştir. Kök hücreler gibi yenilenebilir kaynaklardan podosit türetme yeteneği, insan böbrek gelişimi ve hastalığının mekanizmalarının mevcut olarak anlaşılmasına yardımcı olabileceği gibi terapötik keşif için yeni araçlar sağlayabilir. Bu protokolün amacı, insan kaynaklı pluripotent sap (hiPS) hücrelerinden yüksek verimlilik ve özgüllükle ve kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında olgun, post-mitotik podositler elde etmek için bir yöntem geliştirmekti. Bu yöntemle üretilen hiPS hücre türevi podositler, soyuna özgü belirteçleri (nefrin, podokin ve Wilm Tümörü 1 dahil) ifade eder ve olgun ve fonksiyonel podositlerle ilişkili özel morfolojik özellikleri (birincil ve ikincil ayak süreçleri dahil) sergiler. İlginç bir şekilde, bu özel özellikler, alanda yaygın olarak kullanılan ölümsüzleştirilmiş podosit hücre hattında özellikle yoktur, bu da burada açıklanan protokolün, tipik olarak insan böbrek biyolojisini incelemek için kullanılan mevcut podosit hücre çizgilerinden gelişimsel olarak daha olgun bir fenotipe sahip insan böbrek podositleri ürettiğini göstermektedir.
Introduction
İnsan pluripotent kök hücre kültüründeki gelişmeler, araştırmacılara insan vücudundaki hemen hemen her hücre tipini elde etmek için tasarlanmış yenilenebilir, ölçeklenebilir bir biyolojik malzeme kaynağı sağlayarak rejeneratif tıp, hastalık modelleme ve ilaç taramasında devrim yapmayahazırdır 1. Bu strateji, özellikle elde edilmesi zor olan özel ve işlevsel hücre türlerini türetmek için yararlıdır. İnsan kaynaklı pluripotent stem (hiPS) hücreleri2,3,4,5, somatik hücre kökenleri ve kişiselleştirilmiş tıp için temsil ettikleri potansiyel nedeniyle özellikle çekicidir. Bununla birlikte, hiPS hücrelerinden diğer hücre soylarını türetmek için yöntemler geliştirmek, düşük verimliliğe ve spesifik olmayan heterojen hücre popülasyonlarının üretilmesine yol açan kötü tanımlanmış kültür koşullarının sık kullanımı nedeniyle zor olmaya devam etmektedir6,7.
Burada sunulan, kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında spesifiklik ve yüksek verimlilik ile hiPS hücrelerinden olgun böbrek podositlerinin türetilme yöntemidir. Hücresel mikroçevrim içindeki birden fazla faktörün rolleri göz önünde bulundurularak, hücre kültürü ortamında sunulan çözünür faktörlerin yanı sıra hücre dışı matris bileşenleri veya yapışkan substratlar gibi çözünmeyen faktörlerin optimizasyonunu içeren bir kök hücre farklılaşma stratejisi geliştirilmiştir. Podosit gelişiminde ve fonksiyonunda integrin sinyalinin önemi göz önüne alındığında, hücre yüzeyindeki integrin reseptörlerinin ekspresyolü ilk başta incelenmiştir. β1 integrinleri sadece hiPS hücrelerinde değil, mezoderm ve ara mezoderm hücreleri8, 9,10dahil olmak üzere türevlerinde de yüksek oranda ifade edildi. Sonraki deneyler, β1 integrinlerine bağlanan ligandların (laminin 511 veya laminin 511-E8 parçası dahil) aşağıda açıklanan çözünür endüktif ortamla birlikte kullanıldığında hiPS hücrelerinin yapışmasını ve podositlere farklılaştırılmasını desteklediğini doğruladı.
Hücre soyu taahhüdünün indüksiyonu, ilk olarak Activin A, CHIR99021 ve Y27632 Kaya inhibitörü içeren bir ortamın varlığında iki gün boyunca laminin kaplı yüzeylerde kültürlenen hiPS hücrelerinin erken mezoderm belirteçlerini ifade eden hücrelere farklılaşabileceğini doğrulayarak başlatıldı HAND1, kazkötü ve brachyury8,11. Mezoderm hücrelerinin kemik morfogenetik protein 7 (BMP-7) ve CHIR99021 ile desteklenmiş bir ortamla 14 gün boyunca tedavisi, nefi ifade eden ara mezoderm hücrelerinin türetilmesini sağladı kron-progenitör hücre belirteçleri Wilm’s Tumor 1 (WT1), tek atlanan ilişkili protein 1 (OSR1)8,11ve eşleştirilmiş kutu gen 2 proteini (PAX2)12. Olgun böbrek glomerüler podositleri türetmek için, ara mezoderm hücreleri BMP-7, Activin A, vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF),all-trans retinoik asit ve CHIR99021’den oluşan yeni bir ortamla 4-5 gün boyunca tedavi edildi. Akış sitometrisi ve immünostaining, elde edilen hücrelerin% > 90’ının olgun böbrek podosit 8 , 11,13’ünmoleküler, morfolojik ve fonksiyonel özelliklerini sergilediğini doğrulamak için kullanılmıştır. Bu özellikler birincil ve ikincil ayak süreçlerinin gelişimini içerir; SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 dahil olmak üzere podosit soyuna özgü genlerin ekspresyolü ve podocin, nefrin ve WT114, 15,16gibi proteinlerin ekspresyolü. Ek olarak, hiPS hücre türevi podositlerin, aşağı akış deneylerinin zamanlamasında ek bir esneklik sağlayan ticari olarak mevcut bir orta8,11 kullanılarak dört haftaya kadar in vitro olarak kültürde tutulabileceği bulunmuştur. HiPS-podositlerin saflığını belirlemek için kullanılan akış sitometri panelleri hakkında daha fazla bilgi için lütfen önceki yayınımıza bakın11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu raporda, hiPS hücrelerinden böbrek glomerüler podositlerin üretimi için bir protokol açıklıyoruz. HiPS hücre türevi podositler olgun böbrek podosit fenotipi ile ilişkili morfolojik ve moleküler özellikler sergiler13. Önceki yayınlarda, hiPS hücre türevi podositlerin, perf kullanılabilir bir mikroakışkan organ-on-a-chip cihazında glomerüler mikrovasküler endotel hücreleri ile birlikte kültürlendiğinde böbrek glomerülüsünün yapısını ve seçici filtrasyon işlev…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Duke Üniversitesi Pratt Mühendislik Okulu, Duke Tıp Fakültesi Nefroloji Bölümü, Duke Üniversitesi Tıp Bölümü’nden Bir Sandalye Araştırma Ödülü ve S.M.’ye Burroughs Wellcome Fonu PDEP Kariyer Geçiş Geçici Ödülü tarafından desteklendi. M.B, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı tarafından desteklendi. Bize CÖMERTÇE DU11 kök hücre hattını sağladığı için Bursac Laboratuvarı’na ve Duke Üniversitesi’ndeki Varghese Laboratuvarı’na doku kültürü tesisini grubumuzla geçici olarak paylaştığı için teşekkür ederiz. Bu yayın, Massachusetts Teknoloji Enstitüsü Novartis Kimya Profesörü Prof. Laura L.Kiessling’e 60.
Materials
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T） | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
- Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. 发育生物学. 316, 288-301 (2008).
- Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. 发育生物学. 313, 584-593 (2008).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
- Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
- Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
- Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
- Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
- Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Clevers, H., Nusse, R. Wntβ-Catenin Signaling and Disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
- Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
- Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
- Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
- Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).
