カチオンペプチドキャリアの軟骨内輸送特性の特性
Summary
このプロトコルは、軟骨中のカチオン性ペプチド担体の平衡取り込み、浸透深度および非平衡拡散率を決定する。輸送特性の特性評価は、効果的な生物学的応答を確保するために重要です。これらの方法は、負に荷電した組織を標的にするための最適に荷電した薬剤担体の設計に適用することができる。
Abstract
軟骨のような体内のいくつかの負帯電組織は、負に帯電したアグリカンの高密度化のために標的薬物送達に障壁を提示し、したがって、治療応答を高めるために改善された標的化方法を必要とする。軟骨は負の固定電荷密度が高いため、正に荷電した薬物キャリアで薬物を改変して静電相互作用を利用し、軟骨内薬物輸送を強化することができます。したがって、薬物キャリアの輸送を研究することは、生物学的応答を誘導する際の薬物の有効性を予測する上で極めて重要である。軟骨外植におけるカチオン性ペプチド担体の平衡取り込み、浸透深さ、非平衡拡散率を定量化できる3つの実験の設計を示す。平衡取り込み実験は、周囲の浴と比較して軟骨内の溶質濃度の尺度を提供し、軟骨における薬物の治療濃度を高める薬物キャリアの可能性を予測するのに有用である。共焦点顕微鏡を用いた浸透深度研究は、軟骨の表面から深いゾーンへの1D溶質拡散の視覚的表現を可能にし、これは溶体がマトリックスおよび細胞標的部位に到達するかどうかを評価するために重要である。カスタム設計の搬送チャンバーを用いた非平衡拡散率研究は、組織全体にわたって蛍光標識された溶質の拡散率を特徴付け、組織マトリックスとの結合相互作用の強度を測定することを可能にする。これは軟骨との最適な結合強度のキャリアを設計するために有益である。3つの輸送実験から得られた結果は、薬物送達用途に対する弱く可逆的な電荷相互作用を利用する最適に荷電した薬物キャリアを設計するためのガイドラインを提供する。これらの実験方法は、薬物および薬物薬物キャリアコンジュゲートの輸送を評価するために適用することもできる。また、これらの方法は、半月板、角膜および膜炎のユーモアのような他の負帯電組織を標的にする場合に使用するために適合することができる。
Introduction
体内の負に帯電した組織への薬物送達は、薬物が細胞およびマトリックス標的部位1に到達するために組織の深部に浸透することができないため、依然として課題である。これらの組織のいくつかは、組織内に高負固定電荷密度(FCD)2を作成し、ほとんどの高分子2,3,4の送達の障壁として作用する、密に詰まった負電荷アグリカンからなる。3しかし,、正に荷電した薬物キャリアの助けを借りて、この負に帯電した組織バリアは、実際には持続的な薬物送達1、5、6、75,6のための静電電荷相互作用を介して薬物貯蔵所に変換することができる(図1)。17
図1:CPCの軟骨内送達に基づく充電膝関節腔へのCPCの関節内注入。正に帯電したCPCと負の帯電アグリカングループ間の静電相互作用により、軟骨を通して急速かつ完全な深さの浸透を可能にします。この図は、ベダッガヴァサミら4から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
最近、短長カチオン性ペプチドキャリア(CPC)は、負に帯電した軟骨4に送達するためのより大きなサイズの治療薬を運ぶことができる小さなカチオンドメインを作成することを目的として設計された。流行88、9および9変形性関節症(OA)10などの変性疾患を治療するための軟骨への効果的な薬物送達のために10は、軟骨細胞(軟骨細胞)の大部分が11である組織内の深部に薬物の治療濃度が浸透することが重要である。利用可能ないくつかの潜在的な疾患修飾薬がありますが、これらは効果的に軟骨12、13を標的にすることができないので、13誰もFDAの承認を得ています。したがって、薬物キャリアの輸送特性の評価は、治療応答を誘導する際の薬物の有効性を予測するために必要である。ここでは、CPC4の浸透率と非平衡拡散率の平衡取り込み、浸透の深さ、非平衡拡散率の評価に利用できる3つの別々4の実験を設計した。
最適な治療応答を提供できる軟骨内に十分な薬物濃度があることを保証するために、取り込み実験は軟骨4における平衡CPC濃度を定量化するように設計した。この設計では、軟骨とその周囲浴との間の平衡に従って、軟骨内部の溶質の総量(マトリックスに結合するか、または自由に)を取り込み率を用いて決定することができる。この比率は、軟骨内部の溶出物の濃度を平衡浴の濃度に正規化することによって計算される。原則として、軟骨を通る拡散が電荷相互作用によって補助されない中性溶体は、取り込み率が1未満であろう。逆に、静電相互作用によって輸送が増強されたカチオン性溶体は、1より大きい取り込み率を示す。しかし、CPCで示されるように、最適な正電荷を使用すると、取り込み率(300を超える)4がはるかに高くなる可能性があります。
軟骨内の高い薬剤濃度は治療上の利益を達成するために重要であるが、薬剤が軟骨の完全な厚さを通して拡散することも重要である。したがって、薬剤が軟骨内の深部に到達し、マトリックスおよび細胞標的部位に到達できるように、より効果的な治療法を提供するために、浸透深さを示す研究が必要である。この実験は、軟骨を介した溶物の一方向拡散を評価し、生体内での関節内注射後の軟骨への薬物の拡散をシミュレートするように設計された。共焦点顕微鏡を用いた蛍光イメージングにより、軟骨への浸透深度の評価が可能となる。正味粒子電荷は、マトリックスを通して深い薬物がどのように拡散するかをモデレートする上で重要な役割を果たします。組織FCDに基づく最適な純電荷は、カチオン粒子と陰イオン組織マトリックスとの間の弱い可逆的結合相互作用を可能にするために必要とされる。これは、粒子がマトリックスから切り離すことができるように、いかなる相互作用も十分に弱く、本質的には可逆的であり、組織4の奥深くにある別のマトリックス結合部位に結合できることを意味する。逆に、粒子の過剰正正の正の電荷は、あまりにも強いマトリックス結合が軟骨の表面的なゾーンにおける初期結合部位からの粒子の剥離を防ぐので、拡散に向けて有害であり得る。これは、標的部位の大部分が組織11内に深くあるため、生物学的応答が不十分になる。
結合相互作用の強度をさらに定量するために、軟骨を介した薬物拡散率の分析が有利である。非平衡拡散解析研究は、異なる溶体間のリアルタイム拡散率の比較を可能にする。軟骨の表面的、中期および深いゾーンを通して薬物が拡散するにつれて、結合相互作用の存在は拡散率を大きく変えることができる。結合相互作用が薬剤と軟骨マトリックスとの間に存在する場合、それは有効な拡散性(DEFF)と定義される。この場合、すべての結合部位が占有されると、薬物の拡散率は定常拡散(DSS)によって支配される。異なる溶質のDEFF 間の比較は、マトリックスを有する溶質の相対的結合強度を決定する。特定の溶質について、DEFF とDSS が同じ桁の範囲内にある場合、拡散中に薬物とマトリックスの間に存在する結合が最小限であることを意味する。しかし、DEFF がDSSより大きい場合、マトリックスへの粒子の実質的な結合が存在する。
設計された実験は個々に軟骨を通る溶質輸送の特徴付けを可能にするが、最適に荷電した薬物キャリアを設計するためには全ての結果を含む総合的な分析が必要である。電荷相互作用の弱く、可逆的な性質は粒子拡散速度を制御し、高平衡取り込みおよび軟骨を通して急速な完全な深さの浸透を可能にする。平衡取り込み実験を通じて、非平衡拡散速度研究を用いて検証できる電荷相互作用の結果として高い取り込みを示すキャリアを探す必要があります。しかし、これらの結合相互作用は、軟骨を通して溶質の完全な厚さの浸透を可能にするために、自然界で弱く可逆的であるべきです。理想的な薬剤キャリアは、取り込みおよび高い軟骨内薬物濃度に十分な強い結合を可能にする最適な電荷を有するが、完全な厚さの拡散を妨げるほど強すぎない4。提示された実験は、薬物キャリアを標的とする電荷ベースの組織の設計特性を支援する。これらのプロトコルは、軟骨4を介してCPC輸送を特徴付けるために使用されたが、これらはまた、軟骨および他の負帯電組織を通じて様々な薬物および薬物キャリアに適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する方法およびプロトコルは、負に荷電した組織への標的薬物送達の分野にとって重要である。これらの組織に存在する負の帯電アグリカンの密度が高いため、障壁が生じ、マトリックス内の深い細胞標的部位に薬物が到達するのを防ぎます。この顕著な課題に対処するために、薬物は、輸送速度、取り込みおよび組織内の薬物の結合を高めることができる積極的に荷電した薬物?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、議会主導の医学研究プログラム(CDMRP)契約W81XWH-17-1-0085、および国立衛生研究所R03 EB025903-1を通じて米国国防総省によって資金提供されました。AVは、ノースイースタン大学の工学部学部長フェローシップによって資金提供されました。
Materials
| 316 Stainless Steel SAE Washer | McMaster-Carr | 91950A044 | For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD |
| 96-Well Polystyrene Plate | Fisherbrand | 12566620 | Black |
| Acrylic Thick Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | 100x |
| Bovine Cartilage | Research 87 | N/A | 2-3 weeks old, femoropatellar groove |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP671-1 | |
| CPC+14 | LifeTein | LT1524 | Custom designed peptide |
| CPC+20 | LifeTein | LT1525 | Custom designed peptide |
| CPC+8 | LifeTein | LT1523 | Custom designed peptide |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Dermal Punch | MedBlades | MB5-1 | 3, 4 and 6 mm |
| Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning Costar | 3595 | Clear, 96 well |
| Flexible Wrapping Film | Bemis Parafilm M Laboratory | 1337412 | |
| Gold Seal Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 6378701 | # 1.5, 18×18 mm |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A15 | 1/2" Diameter |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A19 | 3/4" Diameter |
| Laser | Chroma Technology | AT480/30m | Spectrophotometer Laser Light |
| Low-Strength Steel Hex Nut | McMaster-Carr | 90480A007 | 6-32 Thread size |
| LSM 700 Confocal Microscope | Zeiss | LSM 700 | |
| Micro Magnetic Stirring Bars | Bel-Art Spinbar | F37119-0007 | 7×2 mm |
| Multipurpose Neoprene Rubber Sheet | McMaster-Carr | 1370N12 | 1/32" Thickness |
| Non-Fat Dried Bovine Milk | Sigma Aldrich | M7409 | |
| Petri Dish | Chemglass Life Sciences | CGN1802145 | 150 mm diameter |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CMR | 1x |
| Plate Shaker | VWR | 89032-088 | |
| Protease Inhibitors | Thermo Scientific | A32953 | |
| Razor Blades | Fisherbrand | 12640 | |
| R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | Black transport chamber inserts |
| RTV Silicone | Loctite | 234323 | Epoxy, Non-corrosive, clear |
| Scalpel | TedPella | 549-3 | #10, #11 blades |
| Signal Receiver | Chroma Technology | ET515lp | Spectrophotometer Laser Signal Receiver |
| Snap-Cap Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22363204 | 1.5 mL |
| Spatula | TedPella | 13508 | |
| Synergy H1 Microplate Reader | Biotek | H1M | |
| Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw | McMaster-Carr | 90128A153 | 6-32 Thread size, 1" Long |
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