Histologische kleuringen met behulp van vrij zwevende weefselsecties

Summary

De vrij zwevende techniek stelt onderzoekers in staat om histologische kleuringen uit te voeren, waaronder immunohistochemie op vaste weefselsecties om biologische structuren, celtype en eiwitexpressie en lokalisatie te visualiseren. Dit is een efficiënte en betrouwbare histochemische techniek die nuttig kan zijn voor het onderzoeken van een groot aantal weefsels, zoals hersenen, hart en lever.

Abstract

Immunohistochemie is een veelgebruikte techniek om specifieke weefselstructuren te visualiseren, evenals eiwitexpressie en lokalisatie. Twee alternatieve benaderingen worden veel gebruikt om de weefselsecties tijdens de kleuringsprocedure te behandelen, één benadering bestaat uit het rechtstreeks op glasplaten monteren van de secties, terwijl een tweede benadering, de vrij zwevende, het mogelijk maakt om vaste secties te behouden en te kleuren terwijl ze in oplossing worden opgehangen. Hoewel op dia’s gemonteerde en vrij zwevende benaderingen vergelijkbare resultaten kunnen opleveren, zorgt de vrij zwevende techniek voor een betere penetratie van antilichamen en zou dus de voorkeursmethode moeten zijn wanneer dikkere secties moeten worden gebruikt voor 3D-reconstructie van de weefsels, bijvoorbeeld wanneer de focus van het experiment ligt op het verkrijgen van informatie over dendritische en axonale projecties in hersengebieden. Bovendien, omdat de secties in oplossing worden gehouden, kan een enkele aliquot gemakkelijk 30 tot 40 secties herbergen, waarvan de behandeling minder bewerkelijk is, vooral in grootschalige biomedische studies. Hier illustreren we hoe de vrij zwevende methode kan worden toegepast op fluorescerende immunohistochemische kleuring, met een grote focus op hersensecties. We zullen ook bespreken hoe de vrij zwevende techniek gemakkelijk kan worden aangepast aan de individuele behoeften van onderzoekers en kan worden aangepast aan andere weefsels en andere op histochemische basis gebaseerde kleuringen, zoals hematoxyline en eosine en cresylviolet, zolang weefselmonsters correct zijn gefixeerd, meestal met paraformaldehyde of formaline.

Introduction

Immunostaining is een populaire onderzoekspraktijk die 130 jaar geleden begon met de ontdekking van serumantistoffen in 1890 door Von Behring¹. In het begin van de^20e eeuw werden kleurstoffen gehecht aan antigenen en later aan antilichamen als een manier om reacties te kwantificeren en te visualiseren¹, en in 1941 ontwikkelde Albert Coons de eerste fluorescerende antilichaamlabels, een ontdekking die een revolutie teweegbracht in lichtmicroscopie ^2,3. De term “immunostaining” omvat vele technieken die zijn ontwikkeld met behulp van dit principe, waaronder Western blot, flowcytometrie, ELISA, immunocytochemie en immunohistochemie ^3,4. Western blot detecteert de aanwezigheid van specifieke eiwitten uit weefsel- of celextracten⁵. Eiwitten worden gescheiden op grootte met behulp van gel-elektroforese, overgebracht naar een membraan en onderzocht met behulp van antilichamen. Deze techniek geeft de aanwezigheid van eiwit aan en hoeveel eiwit er aanwezig is; het onthult echter geen informatie over de lokalisatie van het eiwit in cellen of weefsels. Een andere methode, immunocytochemie (ICC), labelt eiwitten in cellen, meestal cellen die in vitro worden gekweekt. ICC toont zowel eiwitexpressie als lokalisatie binnen cellulaire compartimenten⁶. Om een specifiek eiwit op weefselniveau te detecteren en te visualiseren, wordt immunohistochemie (IHC) gebruikt.

IHC is een methode die onderzoekers gebruiken om specifieke antigenen in weefsel aan te pakken, gebruikmakend van chemische eigenschappen van het immuunsysteem ^7,8. Door specifieke primaire en secundaire antilichamen te genereren die verband houden met een enzym of een fluorescerende kleurstof, kunnen antigenen van belang worden gelabeld en onthuld in de meeste weefsels (zoals besproken in Mepham en Britten)⁹. De term “immunohistochemie” op zichzelf specificeert niet de etiketteringsmethode die wordt gebruikt om het antigeen van belang te onthullen; deze terminologie wordt dus vaak gecombineerd met de detectietechniek om de etiketteringsmethode duidelijk af te bakenen: chromogene immunohistochemie (CIH) om aan te geven wanneer het secundaire antilichaam is geconjugeerd aan een enzym, zoals peroxidase; of fluorescerend IHC om aan te geven wanneer het secundaire antilichaam is geconjugeerd aan een fluorofoor, zoals fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) of tetramethylrhodamine (TRITC). De selectiviteit van IHC stelt clinici en onderzoekers in staat om eiwitexpressie en -distributie door weefsels te visualiseren, over verschillende gezondheidstoestanden en ziekte¹⁰. In het klinische domein wordt IHC vaak gebruikt om kanker te diagnosticeren, evenals om verschillen in verschillende soorten kanker te bepalen. IHC is ook gebruikt om verschillende soorten microbiële infecties in het lichaam te bevestigen, zoals Hepatitis B of C¹¹. In biomedisch onderzoek wordt IHC vaak gebruikt om eiwitexpressie in weefsels in kaart te brengen en is het belangrijk bij het identificeren van abnormale eiwitten die worden gezien in ziektetoestanden. Neurodegeneratie gaat bijvoorbeeld vaak gepaard met accumulatie van abnormale eiwitten in de hersenen, zoals Αβ-plaques en neurofibrillaire klitten bij de ziekte van Alzheimer. Diermodellen worden dan vaak ontwikkeld om deze pathologische toestanden na te bootsen, en IHC is een methode die onderzoekers gebruiken om de eiwitten van belang te lokaliseren en te kwantificeren 10,12,13. Op onze beurt kunnen we meer te weten komen over de oorzaken van deze ziekten en de complicaties die ermee gepaard gaan.

Er zijn veel stappen betrokken bij het uitvoeren van IHC. Eerst wordt het weefsel van belang verzameld en voorbereid voor kleuring. Aantoonbaar bereiden de meeste onderzoekers vaste weefselmonsters voor, waarbij de perfusie van het fixatief via de bloedsomloop optimaal is omdat het morfologie behoudt ^14,15. Postfixatie van weefselmonsters kan ook worden gebruikt, maar kan minder dan ideale resultaten opleveren¹⁶. Crosslinking fixatieven, zoals formaldehyde, werken door chemische bindingen te creëren tussen eiwitten in het weefsel¹⁷. Vast weefsel wordt vervolgens in zeer dunne lagen of secties gesneden met behulp van een microtoom, waarbij veel onderzoekers er de voorkeur aan geven bevroren secties te verzamelen met behulp van een cryostaat. Van daaruit wordt het weefsel verzameld en ofwel rechtstreeks op een microscoopglaasje gemonteerd (slide-mounted methode), ofwel gesuspendeerd in een oplossing (free-floating methode), zoals fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)¹⁸. De gebruikte verzamelmethode is vooraf bepaald op basis van de behoeften van de onderzoeker, waarbij elk van deze twee methoden zijn eigen voor- en nadelen heeft.

De slide-mounted methode is veruit de meest gebruikte, met als belangrijk voordeel dat zeer dunne secties (10-14 μm) kunnen worden bereid, wat bijvoorbeeld belangrijk is om eiwit-eiwitinteracties te onderzoeken. Er is ook een minimale behandeling van het monster, wat potentiële schade aan de structurele integriteit van het weefsel vermindert¹⁹. Onderzoekers gebruiken deze techniek vaak met vers ingevroren weefsel (weefsel dat onmiddellijk wordt ingevroren met behulp van droogijs, isopentane, enz.), Dat zeer delicaat is in vergelijking met vast weefsel en veel zorg moet worden genomen om ontdooiing van het monster te voorkomen. Een ander voordeel van het gebruik van op dia’s gemonteerde secties is dat grote hoeveelheden oplossingen voor vlekken meestal niet nodig zijn⁴. Onderzoekers kunnen dus een kleinere hoeveelheid dure antilichamen of andere chemicaliën gebruiken om de vlek te voltooien. Bovendien is het mogelijk om secties van verschillende experimentele groepen op dezelfde dia te monteren, wat voordelig kan zijn, vooral tijdens beeldacquisitie. Aan de andere kant zijn er enkele nadelen van het gebruik van op dia’s gemonteerde secties, met name dat het weefselgedeelte aan de dia wordt gehecht, waardoor de penetratie van antilichamen aan één kant van de sectie wordt beperkt, wat de sectiedikte en de 3D-weergave van het weefsel beperkt. Het kan ook gebeuren dat tijdens het wassen de randen van het weefsel en hele secties los kunnen komen van de dia, waardoor het hele experiment nutteloos wordt. Bovendien moet IHC meestal relatief snel worden uitgevoerd bij gebruik van de op glijden gemonteerde benadering om degradatie van het antigeenepithop^20,21 te voorkomen, waarbij onbewerkte dia’s meestal worden opgeslagen bij -20 of -80 °C, vaak bedekt en horizontaal of in schuifdozen worden opgeslagen, wat resulteert in een relatief grote opslagvoetafdruk. Ten slotte kan de op dia’s gemonteerde techniek ook tijdrovend zijn als onderzoekers grote aantallen dia’s moeten verwerken om grote aantallen weefselsecties te verwerken.

Vanwege enkele van deze uitdagingen met behulp van de op dia’s gemonteerde methode, is een wijziging genaamd de free-floating-methode een populair alternatief geworden. Deze techniek kwam in de literatuur in de jaren 1960-70 ^22,23,24, won aan populariteit in de jaren 1980 25,26,27,28,29, en is nu een gevestigde methode waarbij de vlek op de verzamelde secties in suspensie wordt uitgevoerd in plaats van vast te kleven aan een dia 12,30,31 . De vrij zwevende methode wordt niet aanbevolen wanneer weefselsecties minder dan 20 μm bedragen; in onze ervaring is het echter de benadering van keuze wanneer dikkere (40-50 μm) secties moeten worden gekleurd. Een duidelijk voordeel is dat antilichamen vanuit alle hoeken vrij zwevende secties kunnen binnendringen en minder achtergrondvlekken kunnen genereren als gevolg van effectiever wassen, wat allemaal resulteert in een betere signalering bij beeldvorming. Bovendien worden de secties na verwerking op de dia’s gemonteerd, waardoor de mogelijkheid van weefselloslating wordt geëlimineerd en de tijd die de cryostaat in beslag neemt, wordt verkort. De free-floating methode kan ook veel minder arbeidsintensief zijn, vooral voor grootschalige biomedische studies. Het is bijvoorbeeld mogelijk om veel (18-40) secties van hetzelfde monster samen in dezelfde put te kleuren, wat tijd bespaart bij het uitvoeren van zowel de was- als antilichaamincubatiestappen. Bovendien, omdat een groter aantal (12-16) secties per dia kan worden gemonteerd met behulp van deze aanpak, is het vaak handiger en sneller voor de onderzoeker om secties te bekijken en af te beelden. Met name tijdens het monteren van weefselplakken op de dia’s kunnen secties worden bevestigd en losgemaakt totdat de gewenste oriëntatie is verkregen. Onderzoekers gebruiken ook vaak iets lagere concentraties antilichamen met behulp van de vrij zwevende methode, en omdat de incubaties worden uitgevoerd in microcentrifugebuizen, kunnen de antilichamen gemakkelijk worden verzameld en bewaard met natriumazide voor hergebruik (zie stap 5.1). Een ander voordeel is dat de secties direct bij -80 °C kunnen worden opgeslagen in kleine microcentrifugebuizen met cryoprotectantoplossing³², waardoor de opslagruimte wordt geminimaliseerd en de levensduur van de monsters wordt gemaximaliseerd³³. Een nadeel van het gebruik van deze techniek is dat de secties veel worden behandeld en dus vatbaar zijn voor schade. Dit kan echter worden verzacht door lage schud- en rotatiesnelheden te gebruiken en onderzoekers goed te trainen hoe ze de monsters kunnen overbrengen en de secties op de dia’s kunnen monteren.

Alles bij elkaar is IHC een gevestigd, essentieel hulpmiddel voor het visualiseren en lokaliseren van eiwitexpressie in zowel het klinische als het biomedische onderzoek. Free-floating IHC is een efficiënte, flexibele en economische methode, vooral bij het uitvoeren van grootschalige histologische studies. Hier presenteren we een betrouwbaar vrij zwevend fluorescerend IHC-protocol voor de wetenschappelijke gemeenschap dat dienovereenkomstig kan worden aangepast voor chromogene IHC en andere kleuringen zoals hematoxyline en eosine of cresylvioletkleuring.

Protocol

1. Weefselvoorbereiding voor cryosectie Integreer vaste weefsels in een geschikte insluitvorm (zie Tabel van Materialen) om een monsterblok te maken met behulp van een geschikte monstermatrix (zie Tabel van Materialen) en vries in op droogijs. Bewaar de blokken van het monster bij -80 °C totdat u klaar bent om te worden doorgesneden.OPMERKING: Vaste weefsels worden meestal bereid door volwassen (ca. 2,5 – 30 maanden oud) mannelijke of vrouwelijke knaagdieren (muis of rat) …

Representative Results

Het algemene schema van het gebruik van de vrij zwevende methode om een fluorescerende immunohistochemische test uit te voeren, wordt geïllustreerd in figuur 1. Representatief voorbeeld van fluorescerende IHC met behulp van de vrij zwevende methode in muizenhersenen die gliale fibrillaire zure eiwitexpressie (GFAP) onderzoeken, wordt weergegeven in figuur 2 bij zowel lagere als hogere vergroting om de algehele kwaliteit van de kleuring te illustreren. Deze aanp…

Discussion

Immunohistochemie (IHC) is een veelzijdige techniek die cruciaal is geworden bij het identificeren van eiwitexpressie en lokalisatie binnen weefselsecties. Deze test wordt in de hele wetenschappelijke gemeenschap gebruikt om de kenmerken van weefsel verder te begrijpen in stadia van normale functie tot ziektetoestanden. IHC wordt op verschillende gebieden ingezet, van klinische diagnose van ziekten zoals kanker tot eerste ontdekkingen in preklinisch onderzoek^{10,36</sup…}

Materials

12-well plates	Corning	3513
6-well plates	Corning	3516
Clear nail polish	User preference	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Embedding molds	Thermo Scientific	1841
Ethylene glycol	User preference	N/A
Formalin solution	Fisher Scientific	SF98-4
Horse serum, heat inactivated	Gibco	26050088
Microscope slide boxes	Electron Microscopy Services	71370
PBS	User preference	N/A
Primary antibody	User preference	N/A
Rectangular Coverslips	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Rectangular staining dish	Electron Microscopy Services	70312
Round artist paintbrush #2	Princeton Select Series	3750R	Brand not important
Secondary antibody	User preference	N/A
Specimen matrix for embedding	OCT Tissue-Tek, Sakura	4583
Stain tray – slide staining system	Electron Microscopy Services	71396-B	Use dark lid
Sucrose	User preference	N/A
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
TBS	User preference	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000	Non-hardening
Well inserts for 12-well plates	Corning Netwells	3477
Well inserts for 6-well plates	Corning Netwells	3479
Whatman filter paper	Millapore-Sigma	WHA1440042