Serbest Yüzen Doku Kesitleri Kullanılarak Histolojik Tabanlı Boyamalar
Summary
Serbest yüzen teknik, araştırmacıların biyolojik yapıları, hücre tipini ve protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu görselleştirmek için sabit doku kesitlerinde immünohistokimya da dahil olmak üzere histolojik tabanlı boyamalar yapmalarını sağlar. Bu, beyin, kalp ve karaciğer gibi çok sayıda dokuyu araştırmak için yararlı olabilecek etkili ve güvenilir bir histokimyasal tekniktir.
Abstract
İmmünohistokimya, spesifik doku yapılarının yanı sıra protein ekspresyonu ve lokalizasyonunu görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Boyama prosedürü sırasında doku kesitlerini işlemek için iki alternatif yaklaşım yaygın olarak kullanılmaktadır, bir yaklaşım bölümleri doğrudan cam slaytlara monte etmekten oluşurken, ikinci bir yaklaşım olan serbest yüzen, çözelti içinde askıya alınırken sabit bölümlerin korunmasına ve boyanmasına izin verir. Slayta monte edilmiş ve serbest yüzen yaklaşımlar benzer sonuçlar verebilse de, serbest yüzen teknik daha iyi antikor penetrasyonuna izin verir ve bu nedenle dokuların 3D rekonstrüksiyonu için daha kalın bölümler kullanılacaksa, örneğin deneyin odak noktası beyin bölgelerindeki dendritik ve aksonal projeksiyonlar hakkında bilgi edinmek olduğunda tercih edilen yöntem olmalıdır. Ek olarak, bölümler çözelti içinde tutulduğundan, tek bir aliquot, özellikle büyük ölçekli biyomedikal çalışmalarda, kullanımı daha az zahmetli olan 30 ila 40 bölümü kolayca barındırabilir. Burada, serbest yüzen yöntemin floresan immünohistokimya boyamasına nasıl uygulanacağını ve beyin bölümlerine odaklanılacağını gösteriyoruz. Ayrıca, serbest yüzen tekniğin, araştırmacıların bireysel ihtiyaçlarına uyacak şekilde nasıl kolayca değiştirilebileceğini ve doku örnekleri tipik olarak paraformaldehit veya formalin ile düzgün bir şekilde sabitlendiği sürece, hematoksilin ve eozin ve cresyl violet gibi diğer histokimyasal bazlı boyamaların yanı sıra diğer dokulara nasıl uyarlanabileceğini de tartışacağız.
Introduction
İmmünoboyama, 130 yıl önce 1890 yılında Von Behring1 tarafından serum antikorlarının keşfi ile başlayan popüler bir araştırma uygulamasıdır. 20. yüzyılın başlarında, boyalar reaksiyonları ölçmenin ve görselleştirmenin bir yolu olarak antijenlere ve daha sonra antikorlara bağlandı1 ve 1941’de Albert Coons, ışık mikroskobu 2,3’te devrim yaratan bir keşif olan ilk floresan antikor etiketlerini geliştirdi. “İmmünoboyama” terimi, Western blot, flow cytometry, ELISA, immünositokimya ve immünohistokimya 3,4 dahil olmak üzere bu prensip kullanılarak geliştirilen birçok tekniği kapsar. Western blot, doku veya hücre ekstraktlarından spesifik proteinlerin varlığını tespit eder5. Proteinler jel elektroforezi kullanılarak boyuta göre ayrılır, bir zara aktarılır ve antikorlar kullanılarak incelenir. Bu teknik, proteinin varlığını ve ne kadar protein bulunduğunu gösterir; Bununla birlikte, proteinin hücreler veya dokular içindeki lokalizasyonu hakkında herhangi bir bilgi ortaya koymaz. Başka bir yöntem olan immünositokimya (ICC), hücrelerdeki proteinleri, tipik olarak in vitro olarak yetiştirilen hücreleri etiketler. ICC, hücresel bölmelerde hem protein ekspresyonunu hem de lokalizasyonu gösterir6. Doku düzeyinde spesifik bir proteini tespit etmek ve görselleştirmek için immünohistokimya (IHC) kullanılır.
IHC, araştırmacıların bağışıklık sisteminin kimyasal özelliklerinden yararlanarak doku içindeki spesifik antijenleri hedeflemek için kullandıkları bir yöntemdir 7,8. Bir enzime veya floresan boyaya bağlı spesifik birincil ve ikincil antikorlar üretilerek, ilgilenilen antijenler çoğu dokuda etiketlenebilir ve ortaya çıkarılabilir (Mepham ve Britten’de gözden geçirildiği gibi)9. “İmmünohistokimya” terimi tek başına, ilgilenilen antijeni ortaya çıkarmak için kullanılan etiketleme yöntemini belirtmez; Bu nedenle, bu terminoloji genellikle etiketleme yöntemini açıkça tanımlamak için tespit tekniği ile birleştirilir: ikincil antikorun peroksidaz gibi bir enzime ne zaman konjuge olduğunu belirtmek için kromojenik immünohistokimya (CIH); veya ikincil antikorun floresein izotiyosiyanat (FITC) veya tetrametilrodamin (TRITC) gibi bir florofora konjuge olduğunu belirtmek için floresan IHC. IHC’nin seçiciliği, klinisyenlerin ve araştırmacıların dokular boyunca, çeşitli sağlık ve hastalık durumlarında protein ekspresyonunu ve dağılımını görselleştirmelerini sağlar10. Klinik alanda, IHC yaygın olarak kanseri teşhis etmek ve çeşitli kanser türlerindeki farklılıkları belirlemek için kullanılır. IHC ayrıca Hepatit B veya C11 gibi vücuttaki farklı mikrobiyal enfeksiyon türlerini doğrulamak için de kullanılmıştır. Biyomedikal araştırmalarda, IHC genellikle dokulardaki protein ekspresyonunu haritalamak için kullanılır ve hastalık durumlarında görülen anormal proteinleri tanımlamada önemlidir. Örneğin, nörodejenerasyona genellikle Alzheimer hastalığında Αβ plakları ve nörofibriler yumaklar gibi beyinde anormal proteinlerin birikmesi eşlik eder. Hayvan modelleri genellikle bu patolojik durumları taklit etmek için geliştirilir ve IHC, araştırmacıların ilgilendikleri proteinleri bulmak ve ölçmek için kullandıkları bir yöntemdir10,12,13. Buna karşılık, bu hastalıkların nedenleri ve onlarla ortaya çıkan komplikasyonlar hakkında daha fazla bilgi edinebiliriz.
IHC’nin gerçekleştirilmesinde birçok adım vardır. İlk olarak, ilgilenilen doku toplanır ve boyama için hazırlanır. Muhtemelen çoğu araştırmacı sabit doku örnekleri hazırlar, fiksatifin dolaşım sistemi yoluyla perfüzyonu, morfolojiyi koruduğu için optimal 14,15’tir. Doku örneklerinin fiksasyonu sonrası da kullanılabilir, ancak ideal sonuçlardan daha az sonuç verebilir16. Formaldehit gibi çapraz bağlanan fiksatörler, dokudaki proteinler arasında kimyasal bağlar oluşturarak hareket eder17. Sabit doku daha sonra bir mikrotom kullanılarak çok ince tabakalara veya bölümlere dilimlenir, birçok araştırmacı bir kriyostat kullanarak dondurulmuş bölümleri toplamayı tercih eder. Buradan doku toplanır ve ya doğrudan bir mikroskop slaydına (slayta monte edilmiş yöntem) monte edilir ya da fosfat tamponlu salin (PBS) 18 gibi bir çözelti içinde askıya alınır (serbest yüzen yöntem). Kullanılan toplama yöntemi, araştırmacının ihtiyaçlarına göre önceden belirlenir ve bu iki yöntemin her biri kendi avantaj ve dezavantajlarını sunar.
Kızağa monte edilen yöntem açık ara en yaygın kullanılanıdır, önemli bir yararı çok ince kesitlerin (10-14 μm) hazırlanabilmesidir, bu da örneğin protein-protein etkileşimlerini araştırmak için önemlidir. Ayrıca, numunenin minimum düzeyde işlenmesi vardır, bu da dokunun yapısal bütünlüğüne potansiyel hasarı azaltır19. Araştırmacılar genellikle bu tekniği sabit dokuya kıyasla çok hassas olan taze dondurulmuş doku (kuru buz, isopentan vb. kullanılarak hemen dondurulan doku) ile kullanırlar ve numunenin çözülmesini önlemek için çok özen gösterilmesi gerekir. Kızağa monte edilmiş bölümlerin kullanılmasının bir diğer avantajı, boyama için büyük hacimli çözeltilerin genellikle gerekli olmamasıdır4. Böylece, araştırmacılar lekeyi tamamlamak için daha az miktarda pahalı antikor veya diğer kimyasalları kullanabilirler. Ek olarak, birkaç farklı deney grubundan bölümleri aynı slayta monte etmek mümkündür, bu da özellikle görüntü yakalama sırasında avantajlı olabilir. Öte yandan, slayda monte edilmiş bölümlerin kullanılmasının bazı dezavantajları vardır, özellikle doku bölümünün slayda yapıştırılması, böylece bölümün bir tarafına antikor penetrasyonunu kısıtlaması, bu da kesit kalınlığını ve dokunun 3D gösterimini sınırlar. Ayrıca, yıkama sırasında, dokunun kenarlarının ve tüm bölümlerin slayttan ayrılabileceği ve tüm deneyi işe yaramaz hale getirebileceği de olabilir. Dahası, tipik olarak -20 veya -80 ° C’de saklanan, genellikle örtülmüş ve yatay olarak veya slayt kutularında saklanan işlenmemiş slaytlarla antijen epitop 20,21’in bozulmasını önlemek için slayta monte edilmiş yaklaşım kullanıldığında IHC genellikle nispeten hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir, bu da nispeten büyük bir depolama ayak izi ile sonuçlanır. Son olarak, slayta monte tekniği, araştırmacıların çok sayıda doku bölümünü işlemek için çok sayıda slaytı ele almaları gerekiyorsa da zaman alıcı olabilir.
Slayta monte edilmiş yöntemi kullanan bu zorlukların bazıları nedeniyle, serbest yüzen yöntem adı verilen bir değişiklik popüler bir alternatif haline gelmiştir. Bu teknik 1960-70’lerde literatüre girdi 22,23,24, 1980’lerde popülerlik kazandı 25,26,27,28,29 ve şimdi 12,30,31 numaralı slayta yapışmak yerine süspansiyonda toplanan bölümlerdeki lekeyi gerçekleştirmeyi içeren köklü bir yöntemdir. . Doku kesitleri 20 μm’den az olduğunda serbest yüzen yöntem önerilmez; Bununla birlikte, deneyimlerimize göre, daha kalın (40-50 μm) kesitlerin boyanması gerektiğinde tercih edilen yaklaşımdır. Belirgin bir yararı, antikorların serbest yüzen bölümlere tüm açılardan nüfuz edebilmesi ve daha etkili yıkama nedeniyle daha az arka plan lekelenmesi üretebilmesidir, bu da görüntüleme sırasında daha iyi sinyal vermeyle sonuçlanır. Ek olarak, bölümler işlemden sonra slaytlara monte edilir, böylece doku dekolmanı olasılığını ortadan kaldırır ve kriyostatı işgal eden süreyi azaltır. Serbest yüzen yöntem, özellikle büyük ölçekli biyomedikal çalışmalar için çok daha az emek yoğun olabilir. Örneğin, aynı numuneden birçok (18-40) bölümün aynı kuyuda bir araya getirilmesi mümkündür, bu da hem yıkama hem de antikor inkübasyon adımlarının gerçekleştirilmesinde zaman kazandırır. Ayrıca, bu yaklaşım kullanılarak slayt başına daha fazla sayıda (12-16) bölüm monte edilebildiğinden, araştırmacının bölümleri görüntülemesi ve görüntülemesi genellikle daha uygun ve daha hızlıdır. Özellikle, doku dilimlerinin slaytlara montajı sırasında, istenen yön elde edilene kadar bölümler takılabilir ve ayrılabilir. Araştırmacılar ayrıca serbest yüzen yöntemi kullanarak genellikle biraz daha düşük antikor konsantrasyonları kullanırlar ve inkübasyonlar mikrosantrifüj tüplerinde gerçekleştirildiğinden, antikorlar yeniden kullanım için sodyum azid ile kolayca toplanabilir ve korunabilir (bakınız Adım 5.1). Diğer bir avantaj, kesitlerin kriyoprotektan çözeltisi32 ile küçük mikrosantrifüj tüplerinde -80 ° C’de doğrudan saklanabilmesidir, böylece depolama alanını en aza indirir ve numunelerin ömrünü en üst düzeye çıkarır33. Bu tekniği kullanmanın bir dezavantajı, bölümlerin çok fazla ele alınması ve bu nedenle hasara yatkın olmasıdır. Bununla birlikte, bu, düşük sallanma ve dönme hızları kullanılarak ve ayrıca araştırmacıları numunelerin nasıl aktarılacağı ve bölümlerin slaytlara nasıl monte edileceği konusunda uygun şekilde eğiterek hafifletilebilir.
Birlikte ele alındığında, IHC hem klinik hem de biyomedikal araştırma alanlarında protein ekspresyonunu görselleştirmek ve lokalize etmek için yerleşik, gerekli bir araçtır. Serbest yüzen IHC, özellikle büyük ölçekli histolojik çalışmalar gerçekleştirirken verimli, esnek ve ekonomik bir yöntemdir. Burada, bilimsel topluluk için kromojenik IHC ve hematoksilin ve eozin veya cresyl violet boyama gibi diğer boyamalar için uygun şekilde uyarlanabilen güvenilir bir serbest yüzen floresan IHC protokolü sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
İmmünohistokimya (IHC), doku kesitlerinde protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu tanımlamada çok önemli hale gelen çok yönlü bir tekniktir. Bu tahlil, normal fonksiyon aşamalarından hastalık durumlarına kadar dokunun özelliklerini daha iyi anlamak için bilimsel topluluk genelinde kullanılır. IHC, kanser gibi hastalıkların klinik teşhisinden klinik öncesi araştırmalardaki ilk keşiflere kadar çeşitli alanlarda kullanılmaktadır10,36.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ulusal Yaşlanma Enstitüsü’ne (K99/R00 AG055683’ten JMR’ye), George ve Anne Ryan Sinirbilim Enstitüsü’ne (EP, GC, JMR), Rhode Island Üniversitesi Eczacılık Fakültesi’ne (EP, GC, JMR) ve Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse’ye (JMR) teşekkür ederiz. Harvard Tıp Fakültesi Genetik Bölümü Profesörü Susan Dymecki ile eğitim alan doktora öğrencisi Rebecca Senft’e, bizi serbest yüzen yöntemle tanıştırdığı için teşekkür ederiz. Şekil 1’de kullanılan bazı görüntüler “kullanımı ücretsiz, paylaşması veya değiştirmesi, hatta ticari olarak bile ücretsiz” kaynaklardan elde edilmiştir: fare ve mikrosantrifüj tüpü (Pixabay), fare beyni (Jonas Töle, Wikimedia Commons), kriyostat ve fare beyni bölümü (DataBase Yaşam Bilimleri Merkezi, Wikimedia Commons), cam kap (OpenClipart, FreeSvg.org) ve mikroskop (Theresa Knott, Open Clip Art Library).
Materials
| 12-well plates | Corning | 3513 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Clear nail polish | User preference | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Embedding molds | Thermo Scientific | 1841 | |
| Ethylene glycol | User preference | N/A | |
| Formalin solution | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco | 26050088 | |
| Microscope slide boxes | Electron Microscopy Services | 71370 | |
| PBS | User preference | N/A | |
| Primary antibody | User preference | N/A | |
| Rectangular Coverslips | VWR | 48393-081 | 24 x 50 mm |
| Rectangular staining dish | Electron Microscopy Services | 70312 | |
| Round artist paintbrush #2 | Princeton Select Series | 3750R | Brand not important |
| Secondary antibody | User preference | N/A | |
| Specimen matrix for embedding | OCT Tissue-Tek, Sakura | 4583 | |
| Stain tray – slide staining system | Electron Microscopy Services | 71396-B | Use dark lid |
| Sucrose | User preference | N/A | |
| Superfrost Plus Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| TBS | User preference | N/A | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Non-hardening |
| Well inserts for 12-well plates | Corning Netwells | 3477 | |
| Well inserts for 6-well plates | Corning Netwells | 3479 | |
| Whatman filter paper | Millapore-Sigma | WHA1440042 |
References
- Childs, G. V. Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology. Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group. Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Goldman, R. Antibodies: indispensable tools for biomedical research. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).
- Taylor, S. N., Harlow, E. D., Lane, D. Using Antibodies: A Laboratory Manual. The Quarterly Review of Biology. 74 (3), 374 (1999).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Hermersdörfer, H., Beesley, J. E. . Immunocytochemistry. A Practical Approach. 38 (3), 348-348 (1994).
- Schacht, V., Kern, J. S. Basics of Immunohistochemistry. Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
- Coons, A. H. International Review of Cytology. International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).
- Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections. Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4, 307-309 (2012).
- Li, A., Yang, D. H. Methods in Molecular Biology. Methods in Molecular Biology. 2108, 43-55 (2020).
- Hökfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues. Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).
- Okaty, B. W., et al. A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons. bioRxiv. , (2020).
- Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin. Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
- van der Loos, C. A focus on fixation. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
- Bachman, J. Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
- Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).
- Bertheau, P., et al. Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides. Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).
- Blind, C., et al. Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation. Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).
- Desmet, V. J., Krstulović, B., Damme, B. V. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
- Bulmer, D. The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat. Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).
- Lönnerholm, G. Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney. Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).
- Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain. Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).
- Nadelhaft, I. The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).
- Wainer, B. H., Rye, D. B. Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).
- Piekut, D. T., Casey, S. M. Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).
- Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum. The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).
- Kjell, J., et al. Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers. Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).
- Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).
- Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).
- Estrada, L. I., et al. Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).
- Capelozzi, V. L. Papel da imuno-histoquímica no diagnóstico do câncer de pulmão. Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).
- Burry, R. W. . Immunocytochemistry. , 65-77 (2009).
- Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PloS one. 10 (3), 0120120 (2015).
- Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. . Neuroanatomical Tract-Tracing Methods. , 207-262 (1981).
- Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain. Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).
