Гистологические окрашивания с использованием свободно плавающих участков тканей

Summary

Свободно плавающий метод позволяет исследователям выполнять гистологические окрашивания, включая иммуногистохимию на фиксированных участках ткани, для визуализации биологических структур, типа клеток, экспрессии и локализации белка. Это эффективный и надежный гистохимический метод, который может быть полезен для исследования множества тканей, таких как мозг, сердце и печень.

Abstract

Иммуногистохимия является широко используемым методом визуализации специфических тканевых структур, а также экспрессии и локализации белка. Два альтернативных подхода широко используются для обработки участков ткани во время процедуры окрашивания, один подход заключается в монтаже секций непосредственно на стеклянных слайдах, в то время как второй подход, свободно плавающий, позволяет поддерживать и окрашивать фиксированные участки во время подвешивания в растворе. Хотя скользящие и свободно плавающие подходы могут давать аналогичные результаты, свободно плавающий метод позволяет лучше проникать антителам и, следовательно, должен быть методом выбора, когда более толстые участки должны использоваться для 3D-реконструкции тканей, например, когда основное внимание в эксперименте уделяется получению информации о дендритных и аксональных проекциях в областях мозга. Кроме того, поскольку секции хранятся в растворе, одна аликвота может легко вместить от 30 до 40 секций, обработка которых менее трудоемка, особенно в крупномасштабных биомедицинских исследованиях. Здесь мы иллюстрируем, как применять свободно плавающий метод к флуоресцентному иммуногистохимическому окрашиванию, уделяя основное внимание участкам мозга. Мы также обсудим, как свободно плавающая техника может быть легко модифицирована в соответствии с индивидуальными потребностями исследователей и адаптирована к другим тканям, а также к другим гистохимическим окрашиваниям, таким как гематоксилин и эозин и крезил-фиолетовый, если образцы тканей правильно зафиксированы, как правило, с параформальдегидом или формалином.

Introduction

Иммуноокрашивание является популярной исследовательской практикой, которая началась 130 лет назад с открытия сывороточных антител в 1890 году фон Берингом¹. В начале^20-го века красители были прикреплены к антигенам, а затем к антителам как способ количественной оценки и визуализации реакций¹, а в 1941 году Альберт Кунс разработал первые флуоресцентные метки антител, открытие, которое произвело революцию в световой микроскопии ^2,3. Термин «иммуноокрашивание» охватывает многие методы, которые были разработаны с использованием этого принципа, включая вестерн-блоттинг, проточную цитометрию, ИФА, иммуноцитохимию и иммуногистохимию ^3,4. Вестерн-блот обнаруживает присутствие специфических белков из тканевых или клеточных экстрактов⁵. Белки разделяются по размеру с помощью гелевого электрофореза, переносятся на мембрану и исследуются с использованием антител. Эта методика указывает на наличие белка и на то, сколько белка присутствует; однако он не раскрывает никакой информации о локализации белка внутри клеток или тканей. Другой метод, иммуноцитохимия (ICC), маркирует белки внутри клеток, обычно клеток, культивируемых in vitro. ICC показывает как экспрессию белка, так и локализацию в клеточных компартментах⁶. Для обнаружения и визуализации специфического белка на тканевом уровне используется иммуногистохимия (IHC).

IHC – это метод, который исследователи используют для нацеливания на специфические антигены в ткани, используя преимущества химических свойств иммунной системы ^7,8. Генерируя специфические первичные и вторичные антитела, связанные либо с ферментом, либо с флуоресцентным красителем, представляющие интерес антигены могут быть помечены и выявлены в большинстве тканей (как рассмотрено в Mepham и Britten)⁹. Термин «иммуногистохимия» сам по себе не указывает на метод маркировки, который используется для выявления интересующего антигена; таким образом, эта терминология часто сочетается с методом обнаружения, чтобы четко очертить метод маркировки: хромогенная иммуногистохимия (CIH) для указания, когда вторичное антитело конъюгируется с ферментом, таким как пероксидаза; или флуоресцентный IHC, чтобы указать, когда вторичное антитело конъюгируется с флуорофором, таким как флуоресцеин изотиоцианат (FITC) или тетраметилродамин (TRITC). Селективность IHC позволяет клиницистам и исследователям визуализировать экспрессию и распределение белка по тканям, в различных состояниях здоровья и заболевания¹⁰. В клинической сфере IHC обычно используется для диагностики рака, а также для определения различий в различных типах рака. IHC также использовался для подтверждения различных типов микробных инфекций в организме, таких как гепатит B или C¹¹. В биомедицинских исследованиях IHC часто используется для картирования экспрессии белка в тканях и важен для выявления аномальных белков, наблюдаемых в болезненных состояниях. Например, нейродегенерация часто сопровождается накоплением аномальных белков в головном мозге, таких как Αβ-бляшки и нейрофибриллярные клубки при болезни Альцгеймера. Затем животные модели часто разрабатываются для имитации этих патологических состояний, и IHC является одним из методов, которые исследователи используют для определения местоположения и количественной оценки интересующих белков 10,12,13. В свою очередь, мы можем узнать больше о причинах этих заболеваний, и осложнениях, которые возникают при них.

Есть много шагов, связанных с выполнением IHC. Сначала собирается интересующая ткань и подготавливается к окрашиванию. Возможно, большинство исследователей готовят фиксированные образцы тканей, при этом перфузия фиксатора через кровеносную систему является оптимальной, поскольку она сохраняет морфологию^14,15. Постфиксация образцов тканей также может быть использована, но может дать менее идеальные результаты¹⁶. Сшивающие фиксаторы, такие как формальдегид, действуют путем создания химических связей между белками в ткани¹⁷. Фиксированная ткань затем нарезается на очень тонкие слои или участки с использованием микротома, причем многие исследователи предпочитают собирать замороженные участки с помощью криостата. Оттуда ткань собирают и либо монтируют непосредственно на предметное стекло микроскопа (скользящий метод), либо суспендируют в растворе (свободно плавающий метод), таком как фосфатный буферизованный физиологический раствор (PBS)¹⁸. Используемый метод сбора предопределен исходя из потребностей исследователя, причем каждый из этих двух методов представляет свои преимущества и недостатки.

Метод, установленный на слайдах, на сегодняшний день является наиболее часто используемым, с важным преимуществом, заключающимся в том, что могут быть приготовлены очень тонкие срезы (10-14 мкм), что важно, например, для исследования белково-белковых взаимодействий. Существует также минимальное обращение с образцом, что уменьшает потенциальное повреждение структурной целостности ткани¹⁹. Исследователи часто используют эту технику со свежезамороженной тканью (тканью, которая немедленно замораживается с использованием сухого льда, изопентана и т. Д.), Которая очень деликатна по сравнению с фиксированной тканью, и необходимо проявлять большую осторожность для предотвращения оттаивания образца. Еще одним преимуществом использования скользящих секций является то, что большие объемы растворов для окрашивания обычно не требуются⁴. Таким образом, исследователи могут использовать меньшее количество дорогих антител или других химических веществ для завершения окрашивания. Кроме того, можно монтировать секции из нескольких различных экспериментальных групп на одном слайде, что может быть выгодно, особенно во время получения изображения. С другой стороны, есть некоторые недостатки использования секций, установленных на слайдах, в первую очередь то, что участок ткани прилипает к слайду, что ограничивает проникновение антител в одну сторону секции, что ограничивает толщину сечения и 3D-представление ткани. Также может случиться так, что во время стирки края ткани и целые срезы могут отсоединиться от слайда, сделав бесполезным весь эксперимент. Кроме того, IHC обычно должен выполняться относительно быстро при использовании подхода, установленного на слайдах, чтобы избежать деградации эпитопа антигена^20,21 с необработанными слайдами, обычно хранящимися при -20 или -80 ° C, часто покрытыми и хранящимися горизонтально или в слайд-боксах, что приводит к относительно большой площади хранения. Наконец, метод крепления слайдов также может занять много времени, если исследователи должны обрабатывать большое количество слайдов для обработки большого количества участков тканей.

Из-за некоторых из этих проблем с использованием метода slide-mounted модификация, называемая свободно плавающим методом, стала популярной альтернативой. Эта техника вошла в литературу в 1960-70-х^годах 22,23,24, набрав популярность в 1980-х 25,26,27,28,29, и в настоящее время является хорошо зарекомендовавшим себя методом, который включает в себя выполнение пятна на собранных участках в суспензии, а не приклеенное к слайду 12,30,31 . Свободно плавающий метод не рекомендуется, когда срезы тканей составляют менее 20 мкм; однако, по нашему опыту, это подход выбора, когда более толстые (40-50 мкм) участки должны быть окрашены. Одним из явных преимуществ является то, что антитела могут проникать в свободно плавающие участки со всех углов и генерировать меньше фонового окрашивания из-за более эффективной промывки, что приводит к лучшей передаче сигналов при визуализации. Кроме того, секции крепятся на слайды после обработки, что исключает возможность отслоения тканей, а также уменьшает время, занимаемое криостатом. Свободно плавающий метод также может быть гораздо менее трудоемким, особенно для крупномасштабных биомедицинских исследований. Например, можно окрасить многие (18-40) секции из одного и того же образца вместе в одном колодце, что экономит время при выполнении этапов промывки и инкубации антител. Более того, поскольку с помощью этого подхода можно смонтировать большее количество (12-16) секций на слайд, исследователю часто удобнее и быстрее просматривать и обрезать разделы. Примечательно, что во время монтажа срезов ткани на слайдах секции могут быть прикреплены и отсоединены до тех пор, пока не будет достигнута желаемая ориентация. Исследователи также часто используют несколько более низкие концентрации антител с использованием свободно плавающего метода, и поскольку инкубации выполняются в микроцентрифужных трубках, антитела могут быть легко собраны и сохранены с азидом натрия для повторного использования (см. Шаг 5.1). Другим преимуществом является то, что секции могут непосредственно храниться при -80 °C в небольших микроцентрифужных трубках с раствором криопротектора³², тем самым минимизируя пространство для хранения и максимизируя долговечность образцов³³. Недостатком использования этой техники является то, что секции обрабатываются много и, следовательно, подвержены повреждениям. Это, однако, можно смягчить, используя низкие скорости встряхивания и вращения, а также правильно обучая исследователей тому, как переносить образцы и монтировать секции на слайды.

Взятый вместе, IHC является признанным, важным инструментом для визуализации и локализации экспрессии белка как в клинических, так и в биомедицинских исследованиях. Свободно плавающий IHC является эффективным, гибким, а также экономичным методом, особенно при выполнении крупномасштабных гистологических исследований. Здесь мы представляем надежный свободно плавающий флуоресцентный протокол IHC для научного сообщества, который может быть соответствующим образом адаптирован для хромогенного IHC и других окрашиваний, таких как гематоксилин и эозин или крезиловое окрашивание.

Protocol

1. Подготовка тканей к криосечению Встраивайте неподвижные ткани в соответствующую форму для встраивания (см. Таблицу материалов) для создания блока образцов с использованием соответствующей матрицы образца (см. Таблицу материалов) и замораживайте на сухом льду…

Representative Results

Общая схема использования свободно плавающего метода для выполнения флуоресцентного иммуногистохимического анализа проиллюстрирована на фиг.1. Репрезентативный пример флуоресцентного IHC с использованием свободно плавающего метода в мозге мыши, исследующего экспрес…

Discussion

Иммуногистохимия (IHC) является универсальным методом, который стал решающим в выявлении экспрессии и локализации белка в срезах тканей. Этот анализ используется во всем научном сообществе для дальнейшего понимания характеристик тканей на разных стадиях нормальной функции до болезнен…

Materials

12-well plates	Corning	3513
6-well plates	Corning	3516
Clear nail polish	User preference	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Embedding molds	Thermo Scientific	1841
Ethylene glycol	User preference	N/A
Formalin solution	Fisher Scientific	SF98-4
Horse serum, heat inactivated	Gibco	26050088
Microscope slide boxes	Electron Microscopy Services	71370
PBS	User preference	N/A
Primary antibody	User preference	N/A
Rectangular Coverslips	VWR	48393-081	24 x 50 mm
Rectangular staining dish	Electron Microscopy Services	70312
Round artist paintbrush #2	Princeton Select Series	3750R	Brand not important
Secondary antibody	User preference	N/A
Specimen matrix for embedding	OCT Tissue-Tek, Sakura	4583
Stain tray – slide staining system	Electron Microscopy Services	71396-B	Use dark lid
Sucrose	User preference	N/A
Superfrost Plus Micro Slides	VWR	48311-703
TBS	User preference	N/A
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vectashield antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000	Non-hardening
Well inserts for 12-well plates	Corning Netwells	3477
Well inserts for 6-well plates	Corning Netwells	3479
Whatman filter paper	Millapore-Sigma	WHA1440042