تلطيخ قائم على الأنسجة باستخدام أقسام الأنسجة العائمة الحرة
Summary
تسمح تقنية الطفو الحر للباحثين بإجراء تلطيخ قائم على الأنسجة بما في ذلك الكيمياء المناعية على أقسام الأنسجة الثابتة لتصور الهياكل البيولوجية ونوع الخلية وتعبير البروتين وتوطينه. هذه تقنية كيميائية نسيجية فعالة وموثوقة يمكن أن تكون مفيدة لفحص العديد من الأنسجة ، مثل الدماغ والقلب والكبد.
Abstract
الكيمياء الهيستولوجية المناعية هي تقنية تستخدم على نطاق واسع لتصور هياكل أنسجة معينة بالإضافة إلى تعبير البروتين وتوطينه. يتم استخدام طريقتين بديلتين على نطاق واسع للتعامل مع أقسام الأنسجة أثناء إجراء التلوين ، ويتكون أحد الأساليب من تركيب الأقسام مباشرة على شرائح زجاجية ، بينما يسمح النهج الثاني ، وهو الطفو الحر ، بالحفاظ على الأقسام الثابتة وتلطيخها أثناء تعليقها في المحلول. على الرغم من أن النهج المثبتة على الشرائح والعائمة الحرة قد تسفر عن نتائج مماثلة ، إلا أن تقنية الطفو الحر تسمح باختراق أفضل للأجسام المضادة ، وبالتالي يجب أن تكون الطريقة المفضلة عند استخدام أقسام أكثر سمكا لإعادة بناء الأنسجة 3D ، على سبيل المثال عندما يكون تركيز التجربة هو الحصول على معلومات حول الإسقاطات المتغصنة والمحورية في مناطق الدماغ. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن الأقسام يتم الاحتفاظ بها في محلول ، يمكن أن تستوعب القسمة الواحدة بسهولة من 30 إلى 40 قسما ، والتعامل معها أقل شاقة ، لا سيما في الدراسات الطبية الحيوية واسعة النطاق. هنا ، نوضح كيفية تطبيق طريقة الطفو الحر على تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية الفلورية ، مع التركيز بشكل كبير على أقسام الدماغ. سنناقش أيضا كيف يمكن بسهولة تعديل تقنية الطفو الحر لتناسب الاحتياجات الفردية للباحثين وتكييفها مع الأنسجة الأخرى بالإضافة إلى البقع الكيميائية النسيجية الأخرى ، مثل الهيماتوكسيلين والإيوزين والكريسيل البنفسجي ، طالما أن عينات الأنسجة ثابتة بشكل صحيح ، عادة باستخدام بارافورمالدهيد أو الفورمالين.
Introduction
Immunostaining هي ممارسة بحثية شائعة بدأت منذ 130 عاما باكتشاف الأجسام المضادة في المصل في عام 1890 بواسطة Von Behring1. خلالأوائل القرن العشرين ، تم ربط الأصباغ بالمستضدات وبعد ذلك بالأجسام المضادة كوسيلة لتحديد وتصور التفاعلات1 ، وفي عام 1941 طور ألبرت كونز أول تسميات الأجسام المضادة الفلورية ، وهو اكتشاف أحدث ثورة في الفحص المجهري الضوئي 2,3. يشمل مصطلح “التلوين المناعي” العديد من التقنيات التي تم تطويرها باستخدام هذا المبدأ ، بما في ذلك اللطخة الغربية ، وقياس التدفق الخلوي ، و ELISA ، والكيمياء المناعية ، والكيمياء المناعية 3,4. لطخة غربية تكتشف وجود بروتينات معينة من مستخلصات الأنسجة أو الخلايا5. يتم فصل البروتينات حسب الحجم باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي ، ونقلها إلى غشاء ، وفحصها باستخدام الأجسام المضادة. تشير هذه التقنية إلى وجود البروتين وكمية البروتين الموجودة ؛ ومع ذلك ، فإنه لا يكشف عن أي معلومات عن توطين البروتين داخل الخلايا أو الأنسجة. طريقة أخرى ، الكيمياء المناعية (ICC) ، تسمي البروتينات داخل الخلايا ، وعادة ما تكون الخلايا المزروعة في المختبر. يظهر ICC كلا من تعبير البروتين وتوطينه داخل المقصورات الخلوية6. للكشف عن بروتين معين وتصوره على مستوى الأنسجة ، يتم استخدام الكيمياء المناعية (IHC).
IHC هي طريقة يستخدمها الباحثون لاستهداف مستضدات معينة داخل الأنسجة ، والاستفادة من الخصائص الكيميائية للجهاز المناعي 7,8. من خلال توليد أجسام مضادة أولية وثانوية محددة مرتبطة إما بإنزيم أو صبغة فلورية ، يمكن تسمية المستضدات ذات الأهمية والكشف عنها في معظم الأنسجة (كما تمت مراجعتها في Mepham and Britten)9. مصطلح “الكيمياء الهيستولوجية المناعية” في حد ذاته لا يحدد طريقة وضع العلامات المستخدمة للكشف عن المستضد محل الاهتمام. وبالتالي ، غالبا ما يتم دمج هذه المصطلحات مع تقنية الكشف لتحديد طريقة وضع العلامات بوضوح: الكيمياء المناعية الكروموجينية (CIH) للإشارة إلى متى يقترن الجسم المضاد الثانوي بإنزيم ، مثل البيروكسيداز. أو IHC الفلوري للإشارة إلى وقت اقتران الجسم المضاد الثانوي بالفلوروفور ، مثل فلوريسئين إيزوثيوسيانات (FITC) أو رباعي ميثيل رودامين (TRITC). تسمح انتقائية IHC للأطباء والباحثين بتصور تعبير البروتين وتوزيعه في جميع أنحاء الأنسجة ، عبر حالات مختلفة من الصحة والمرض10. في المجال السريري ، يستخدم IHC بشكل شائع لتشخيص السرطان ، وكذلك لتحديد الاختلافات في أنواع مختلفة من السرطان. كما تم استخدام IHC لتأكيد أنواع مختلفة من الالتهابات الميكروبية داخل الجسم ، مثل التهاب الكبد B أو C11. في الأبحاث الطبية الحيوية ، غالبا ما تستخدم IHC لرسم خريطة تعبير البروتين في الأنسجة وهي مهمة في تحديد البروتينات غير الطبيعية التي تظهر في حالات المرض. على سبيل المثال ، غالبا ما يصاحب التنكس العصبي تراكم بروتينات غير طبيعية في الدماغ ، مثل لويحات Αβ والتشابك العصبي الليفي في مرض الزهايمر. غالبا ما يتم تطوير النماذج الحيوانية لتقليد هذه الحالات المرضية ، و IHC هي إحدى الطرق التي يستخدمها الباحثون لتحديد وقياس البروتينات ذات الأهمية10،12،13. في المقابل ، يمكننا معرفة المزيد عن أسباب هذه الأمراض ، والمضاعفات التي تنشأ معها.
هناك العديد من الخطوات المتضمنة في أداء المدينة العالمية للخدمات الإنسانية. أولا ، يتم جمع الأنسجة ذات الأهمية وإعدادها للتلطيخ. يمكن القول إن معظم الباحثين يعدون عينات الأنسجة الثابتة ، مع تروية المثبت عبر الدورة الدموية كونها الأمثل لأنها تحافظ على مورفولوجيا14,15. يمكن أيضا استخدام ما بعد تثبيت عينات الأنسجة ولكنها قد تسفر عن نتائج أقل من المثالية16. تعمل المثبتات المتشابكة ، مثل الفورمالديهايد ، عن طريق إنشاء روابط كيميائية بين البروتينات في الأنسجة17. ثم يتم تقطيع الأنسجة الثابتة إلى طبقات أو أقسام رقيقة جدا باستخدام ميكروتوم ، حيث يفضل العديد من الباحثين جمع الأقسام المجمدة باستخدام cryostat. من هناك يتم جمع الأنسجة وإما تركيبها مباشرة على شريحة مجهرية (طريقة مثبتة على شريحة) ، أو تعليقها في محلول (طريقة عائمة حرة) ، مثل محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)18. يتم تحديد طريقة الجمع المستخدمة مسبقا بناء على احتياجات الباحث ، حيث تقدم كل من هاتين الطريقتين مزاياها وعيوبها.
الطريقة المثبتة على الشريحة هي الأكثر استخداما إلى حد بعيد ، مع فائدة مهمة تتمثل في أنه يمكن تحضير أقسام رقيقة جدا (10-14 ميكرومتر) ، وهو أمر مهم ، على سبيل المثال ، للتحقيق في تفاعلات البروتين والبروتين. هناك أيضا الحد الأدنى من التعامل مع العينة ، مما يقلل من الضرر المحتمل للسلامة الهيكلية للأنسجة19. غالبا ما يستخدم الباحثون هذه التقنية مع الأنسجة المجمدة الطازجة (الأنسجة التي يتم تجميدها على الفور باستخدام الثلج الجاف ، الأيزوبنتان ، إلخ) ، وهي حساسة للغاية مقارنة بالأنسجة الثابتة ويجب توخي الحذر الشديد لمنع ذوبان العينة. ميزة أخرى لاستخدام المقاطع المثبتة على الشرائح هي أن كميات كبيرة من حلول التلوين عادة ما تكون غير مطلوبة4. وبالتالي ، يمكن للباحثين استخدام كمية أقل من الأجسام المضادة باهظة الثمن أو المواد الكيميائية الأخرى لإكمال البقعة. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن تركيب أقسام من عدة مجموعات تجريبية مختلفة على نفس الشريحة ، والتي يمكن أن تكون مفيدة ، خاصة أثناء الحصول على الصور. من ناحية أخرى ، هناك بعض عيوب استخدام الأقسام المثبتة على الشريحة ، وأبرزها أن قسم الأنسجة ملتصق بالشريحة وبالتالي يحد من اختراق الأجسام المضادة إلى جانب واحد من القسم ، مما يحد من سمك القسم وتمثيل 3D للأنسجة. يمكن أن يحدث أيضا أنه أثناء الغسيل ، قد تنفصل حواف الأنسجة والأقسام بأكملها عن الشريحة ، مما يجعل التجربة بأكملها عديمة الفائدة. علاوة على ذلك ، يجب إجراء IHC عادة بسرعة نسبية عند استخدام النهج المثبت على الشريحة لتجنب تدهور مستضد المستضد 20,21 مع شرائح غير معالجة يتم تخزينها عادة عند –20 أو –80 درجة مئوية ، وغالبا ما يتم تغطيتها وتخزينها أفقيا أو في صناديق منزلقة ، مما يؤدي إلى بصمة تخزين كبيرة نسبيا. أخيرا ، يمكن أن تستغرق التقنية المثبتة على الشريحة وقتا طويلا إذا كان على الباحثين التعامل مع أعداد كبيرة من الشرائح لمعالجة أعداد كبيرة من أقسام الأنسجة.
نظرا لبعض هذه التحديات باستخدام الطريقة المثبتة على الشريحة ، أصبح تعديل يسمى طريقة التعويم الحر بديلا شائعا. جاءت هذه التقنية في الأدبيات في 1960-70s 22،23،24 ، واكتسبت شعبية في 1980s25،26،27،28،29 ، وهي الآن طريقة راسخة تتضمن أداء البقعة على الأقسام المجمعة في التعليق بدلا من الالتزام بشريحة 12،30،31 . لا ينصح باستخدام طريقة الطفو الحر عندما تكون أقسام الأنسجة أقل من 20 ميكرومتر ؛ ومع ذلك ، في تجربتنا ، هذا هو النهج المفضل عندما يتم تلطيخ الأقسام السميكة (40-50 ميكرومتر). تتمثل إحدى الفوائد المميزة في أن الأجسام المضادة يمكنها اختراق المقاطع العائمة الحرة من جميع الزوايا وتوليد تلطيخ أقل للخلفية بسبب الغسيل الأكثر فعالية ، وكل ذلك يؤدي إلى إشارات أفضل عند التصوير. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تثبيت الأقسام على الشرائح بعد المعالجة ، وبالتالي القضاء على إمكانية انفصال الأنسجة وكذلك تقليل الوقت الذي يشغل cryostat. يمكن أن تكون طريقة التعويم الحر أقل كثافة في العمل ، خاصة بالنسبة للدراسات الطبية الحيوية واسعة النطاق. على سبيل المثال ، من الممكن تلطيخ العديد من الأقسام (18-40) من نفس العينة معا في نفس البئر ، مما يوفر الوقت في أداء كل من خطوات الغسيل وحضانة الأجسام المضادة. علاوة على ذلك ، نظرا لأنه يمكن تركيب عدد أكبر (12-16) من الأقسام لكل شريحة باستخدام هذا الأسلوب ، فغالبا ما يكون أكثر ملاءمة وأسرع للباحث لعرض الأقسام وتصويرها. والجدير بالذكر أنه أثناء تركيب شرائح الأنسجة على الشرائح ، يمكن إرفاق الأقسام وفصلها حتى يتم الحصول على الاتجاه المطلوب. غالبا ما يستخدم الباحثون أيضا تركيزات أقل قليلا من الأجسام المضادة باستخدام طريقة الطفو الحر ، وبما أن الحضانة تتم في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، يمكن جمع الأجسام المضادة بسهولة وحفظها باستخدام أزيد الصوديوم لإعادة استخدامها (انظر الخطوة 5.1). ميزة أخرى هي أنه يمكن تخزين الأقسام مباشرة عند -80 درجة مئوية في أنابيب طرد مركزي صغيرة مع محلول واقي من التبريد32 ، وبالتالي تقليل مساحة التخزين وزيادة طول عمر العينات33. الجانب السلبي لاستخدام هذه التقنية هو أن الأقسام يتم التعامل معها كثيرا ، وبالتالي فهي عرضة للتلف. ومع ذلك ، يمكن التخفيف من ذلك باستخدام سرعات اهتزاز ودوران منخفضة بالإضافة إلى تدريب الباحثين بشكل صحيح على كيفية نقل العينات وتركيب الأقسام على الشرائح.
تعد المدينة العالمية للخدمات الإنسانية مجتمعة أداة راسخة وأساسية لتصور وتوطين تعبير البروتين في كل من مجالات البحوث السريرية والطبية الحيوية. تعتبر IHC العائمة الحرة طريقة فعالة ومرنة واقتصادية ، خاصة عند إجراء دراسات نسيجية واسعة النطاق. هنا ، نقدم بروتوكول IHC الفلوري العائم الحر الموثوق به للمجتمع العلمي والذي يمكن تكييفه وفقا لذلك مع IHC الكروموجينيك والبقع الأخرى مثل الهيماتوكسيلين واليوزين أو تلطيخ الكريسيل البنفسجي.
Protocol
Representative Results
Discussion
الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) هي تقنية متعددة الاستخدامات أصبحت حاسمة في تحديد تعبير البروتين وتوطينه داخل أقسام الأنسجة. يستخدم هذا الفحص في جميع أنحاء المجتمع العلمي لزيادة فهم خصائص الأنسجة عبر مراحل الوظيفة الطبيعية لحالات المرض. يتم توظيف IHC في مجموعة متنوعة من المجالات من الت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف بالمعهد الوطني للشيخوخة (K99 / R00 AG055683 إلى JMR) ، ومعهد جورج وآن ريان لعلم الأعصاب (EP ، GC ، JMR) ، وكلية الصيدلة في جامعة رود آيلاند (EP ، GC ، JMR) ، و Konung Gustaf V: s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). نشكر طالبة الدكتوراه ريبيكا سينفت ، التي تتدرب مع الأستاذة سوزان ديميكي ، قسم علم الوراثة ، كلية الطب بجامعة هارفارد ، لتعريفنا بطريقة التعويم الحر. تم الحصول على بعض الصور المستخدمة في الشكل 1 من مصادر “مجانية الاستخدام أو المشاركة أو التعديل ، حتى تجاريا”: أنبوب الماوس والطرد المركزي الدقيق (Pixabay) ، دماغ الفأر (Jonas Töle ، ويكيميديا كومنز) ، قسم cryostat ودماغ الفأر (مركز قاعدة البيانات لعلوم الحياة ، ويكيميديا كومنز) ، حاوية زجاجية (OpenClipart ، FreeSvg.org) ، والمجهر (تيريزا نوت ، مكتبة القصاصات الفنية المفتوحة).
Materials
| 12-well plates | Corning | 3513 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Clear nail polish | User preference | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Embedding molds | Thermo Scientific | 1841 | |
| Ethylene glycol | User preference | N/A | |
| Formalin solution | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco | 26050088 | |
| Microscope slide boxes | Electron Microscopy Services | 71370 | |
| PBS | User preference | N/A | |
| Primary antibody | User preference | N/A | |
| Rectangular Coverslips | VWR | 48393-081 | 24 x 50 mm |
| Rectangular staining dish | Electron Microscopy Services | 70312 | |
| Round artist paintbrush #2 | Princeton Select Series | 3750R | Brand not important |
| Secondary antibody | User preference | N/A | |
| Specimen matrix for embedding | OCT Tissue-Tek, Sakura | 4583 | |
| Stain tray – slide staining system | Electron Microscopy Services | 71396-B | Use dark lid |
| Sucrose | User preference | N/A | |
| Superfrost Plus Micro Slides | VWR | 48311-703 | |
| TBS | User preference | N/A | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Non-hardening |
| Well inserts for 12-well plates | Corning Netwells | 3477 | |
| Well inserts for 6-well plates | Corning Netwells | 3479 | |
| Whatman filter paper | Millapore-Sigma | WHA1440042 |
References
- Childs, G. V. Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology. Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group. Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Goldman, R. Antibodies: indispensable tools for biomedical research. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).
- Taylor, S. N., Harlow, E. D., Lane, D. Using Antibodies: A Laboratory Manual. The Quarterly Review of Biology. 74 (3), 374 (1999).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Hermersdörfer, H., Beesley, J. E. . Immunocytochemistry. A Practical Approach. 38 (3), 348-348 (1994).
- Schacht, V., Kern, J. S. Basics of Immunohistochemistry. Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
- Coons, A. H. International Review of Cytology. International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).
- Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections. Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4, 307-309 (2012).
- Li, A., Yang, D. H. Methods in Molecular Biology. Methods in Molecular Biology. 2108, 43-55 (2020).
- Hökfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues. Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).
- Okaty, B. W., et al. A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons. bioRxiv. , (2020).
- Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin. Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
- van der Loos, C. A focus on fixation. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
- Bachman, J. Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
- Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).
- Bertheau, P., et al. Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides. Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).
- Blind, C., et al. Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation. Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).
- Desmet, V. J., Krstulović, B., Damme, B. V. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
- Bulmer, D. The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat. Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).
- Lönnerholm, G. Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney. Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).
- Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain. Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).
- Nadelhaft, I. The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).
- Wainer, B. H., Rye, D. B. Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).
- Piekut, D. T., Casey, S. M. Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).
- Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum. The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).
- Kjell, J., et al. Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers. Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).
- Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).
- Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).
- Estrada, L. I., et al. Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).
- Capelozzi, V. L. Papel da imuno-histoquímica no diagnóstico do câncer de pulmão. Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).
- Burry, R. W. . Immunocytochemistry. , 65-77 (2009).
- Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PloS one. 10 (3), 0120120 (2015).
- Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. . Neuroanatomical Tract-Tracing Methods. , 207-262 (1981).
- Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain. Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).
