T- en B-celreceptor immuunrepertoireanalyse met behulp van next-generation sequencing
Summary
Het huidige protocol beschrijft een methode voor DNA-isolatie van bloedmonsters en darmbiopten, generatie van TCRβ- en IGH PCR-bibliotheken voor de volgende generatie sequencing, prestaties van een NGS-run en basisgegevensanalyse.
Abstract
Immunologisch geheugen, het kenmerk van adaptieve immuniteit, wordt georkestreerd door T- en B-lymfocyten. In omloop en verschillende organen zijn er miljarden unieke T- en B-cel klonen, en elk kan een specifiek antigeen binden, wat leidt tot proliferatie, differentiatie en / of cytokinesecretie. De enorme heterogeniteit in T- en B-cellen wordt gegenereerd door willekeurige recombinatie van verschillende genetische segmenten. Next-generation sequencing (NGS) technologieën, ontwikkeld in het afgelopen decennium, maken een ongekend diepgaand beeld van het T- en B-celreceptor-immuunrepertoire mogelijk. Studies bij verschillende ontstekingsaandoeningen, immunodeficiënties, infecties en maligniteiten toonden duidelijke veranderingen aan in clonaliteit, gengebruik en biofysische eigenschappen van immuunrepertoire, wat belangrijke inzichten gaf over de rol van adaptieve immuunresponsen bij verschillende aandoeningen.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor NGS van immuunrepertoire van T- en B-cellen uit bloed en weefsel. We presenteren een pijplijn die begint met DNA-isolatie door bibliotheekvoorbereiding, sequencing op NGS-sequencer en eindigt met basisanalyses. Deze methode maakt het mogelijk om specifieke T- en B-cellen op nucleotide- of aminozuurniveau te verkennen en kan zo dynamische veranderingen in lymfocytenpopulaties en diversiteitsparameters bij verschillende ziekten identificeren. Deze techniek komt langzaam in de klinische praktijk en heeft het potentieel voor identificatie van nieuwe biomarkers, risicostratificatie en precisiegeneeskunde.
Introduction
Het adaptieve immuunsysteem, bestaande uit T- en B-lymfocyten, maakt gebruik van immunologisch geheugen om een eerder aangetroffen antigeen te herkennen en een snelle reactie te initiëren. Lymfocyten worden gegenereerd in het beenmerg en rijpen in de thymus (T-cellen) of het beenmerg (B-cellen). Zowel de T-celreceptor (TCR) als de B-celreceptor (BCR) vertonen unieke configuraties die herkenning van specifieke antigenen mogelijk maken. In homeostase circuleren en onderzoeken T- en B-cellen voortdurend de triljoenen verschillende peptiden die worden gepresenteerd op antigeen-presenterende cellen. TCR- of BCR-ligatie van een specifiek antigeen met een hoge affiniteit, samen met de juiste co-stimulatie, leidt tot celactivatie, wat resulteert in cytokinesecretie, klonale expansie en generatie van antilichamen, in het geval van B-cellen.
De enorme reeks van de verschillende T- of B-cellen wordt gezamenlijk immuunrepertoire genoemd, waardoor talloze verschillende epitopen kunnen worden herkennen. Om zo’n uitgebreid repertoire te genereren, vindt een complex proces van willekeurige assemblage van verschillende gensegmenten plaats, waardoor bijna eindeloze combinaties van receptoren ontstaan die unieke antigenen kunnen binden1. Dit proces, V(D)J recombinatie genoemd, omvat herschikkingen van verschillende variabele (V), diversiteit (D) en het samenvoegen van (J) genen, vergezeld van willekeurige deleties en invoegingen van nucleotiden in de knooppunten2.
De architectuur van het adaptieve immuunsysteem interesseert wetenschappers al tientallen jaren op verschillende gebieden. In het verleden werden Sanger-sequencing, complementaire bepalende regio 3 (CDR3) spectratypering en flowcytometrie gebruikt om het immuunrepertoire te karakteriseren, maar zorgden voor een lage resolutie. In het afgelopen decennium maakten de vooruitgang in next-generation sequencing (NGS) methoden diepgaand inzicht in de kenmerken en samenstelling van iemands TCR- en BCR-repertoires3,4. Deze HTS-sequentie (High Throughput Systems) sequentie en verwerken miljoenen herschikte TCR- of BCR-producten tegelijkertijd en maken een hoge-resolutieanalyse van specifieke T- en B-cellen op nucleotide- of aminozuurniveau mogelijk. NGS biedt een nieuwe strategie om het immuunrepertoire in zowel gezondheid als ziekte te bestuderen. Studies met HTS toonden veranderde TCR- en BCR-repertoires aan bij auto-immuunziekten5, primaire immunodeficiënties6,7en maligniteiten, zoals bij acute myeloïde leukemie8. Met behulp van NGS hebben wij en anderen oligoklonale expansie van specifieke T- en B-celklonen aangetoond, bij patiënten met inflammatoire darmziekte (IBD), waaronder colitis ulcerosa en de ziekte van Crohn9,10,11,12,13,14. Over het algemeen suggereren studies uit verschillende gebieden dat veranderingen in het repertoire een cruciale rol spelen bij de pathogenese van immuungemedieerde aandoeningen.
Het huidige protocol beschrijft een methode voor isolatie van DNA uit intestinale biopten en bloed, het genereren van TCRβ- en IGH PCR-bibliotheken voor NGS en de prestaties van sequencing run. We bieden ook basisstappen in de analyse van immuunrepertoiregegevens. Dit protocol kan ook worden toegepast voor het genereren van TCRα-, TCRγ- en IGL-bibliotheken. De methode is ook compatibel met andere organen (bijv. lymfeklieren, tumoren, synoviale vloeistof, vetweefsel, enz.) zolang weefselspecifieke spijsverteringsprotocollen worden gebruikt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Veranderingen in overvloed en functie van B- en T-lymfocyten worden vaak aangetroffen in verschillende maligniteiten18, chronische ontstekingsstoornissen (bijv. colitis ulcerosa en reumatoïde artritis)10,19, en in verschillende immunodeficiënties17,20. De huidige methode maakt gebruik van NGS om een diepgaand beeld van TCR- en BCR-repertoires te vergemakkelijken, waardoor subtiel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
geen.
Materials
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
References
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
- Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
- Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
- Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
- Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
- Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
- Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn’s Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
- Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
- Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
- Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn’s disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
- Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn’s and Colitis. , (2019).
- Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn’s disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
- Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
- H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
- Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
- Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
- Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
- Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
- Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
- Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
- Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
- Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
- Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
- De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
- Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
- Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).
