Анализ иммунного репертуара рецепторов Т- и В-клеток с использованием секвенирования следующего поколения
Summary
Текущий протокол описывает метод выделения ДНК из образцов крови и биопсии кишечника, генерацию библиотек TCRβ и IGH PCR для секвенирования следующего поколения, производительность запуска NGS и анализ основных данных.
Abstract
Иммунологическая память, отличительная черта адаптивного иммунитета, управляется Т- и В-лимфоцитами. В кровообращении и различных органах существуют миллиарды уникальных клонов Т- и В-клеток, и каждый из них может связывать определенный антиген, что приводит к пролиферации, дифференцировке и / или секреции цитокинов. Огромная гетерогенность т- и в-в-клеток порождается случайной рекомбинацией различных генетических сегментов. Технологии секвенирования следующего поколения (NGS), разработанные в последнее десятилетие, позволяют беспрецедентно глубоко взглянуть на иммунный репертуар рецепторов Т- и В-клеток. Исследования различных воспалительных состояний, иммунодефициентов, инфекций и злокачественных новообразований продемонстрировали заметные изменения в клональности, использовании генов и биофизических свойствах иммунного репертуара, предоставляя важную информацию о роли адаптивных иммунных реакций при различных расстройствах.
Здесь мы предоставляем подробный протокол для NGS иммунного репертуара Т- и В-клеток из крови и тканей. Мы представляем конвейер, начиная от выделения ДНК через подготовку библиотеки, секвенирование на секвенсоре NGS и заканчивая базовыми анализами. Этот метод позволяет исследовать специфические Т- и В-клетки на нуклеотидном или аминокислотном уровне и, таким образом, может идентифицировать динамические изменения в популяциях лимфоцитов и параметры разнообразия при различных заболеваниях. Этот метод медленно входит в клиническую практику и имеет потенциал для идентификации новых биомаркеров, стратификации риска и точной медицины.
Introduction
Адаптивная иммунная система, состоящая из Т- и В-лимфоцитов, использует иммунологическую память для распознавания ранее встречавщегося антигена и инициирования быстрого ответа. Лимфоциты генерируются в костном мозге и созревают в тимусе (Т-клетки) или костном мозге (В-клетки). Как рецептор Т-клеток (TCR), так и рецептор B-клеток (BCR) демонстрируют уникальные конфигурации, которые позволяют распознать специфические антигены. В гомеостазе Т- и В-клетки постоянно циркулируют и исследуют триллионы различных пептидов, представленных на антигенпрезентирующих клетках. TCR или BCR лигирование специфического антигена с высоким сродством вместе с соответствующей костимуляцией приводит к активации клеток, что приводит к секреции цитокинов, клональной экспансии и генерации антител, в случае В-клеток.
Огромный массив различных Т- или В-клеток в совокупности называется иммунным репертуаром, что позволяет распознавать бесчисленное множество различных эпитопов. Для того, чтобы сформировать такой обширный репертуар, происходит сложный процесс случайной сборки различных сегментов генов, создавая почти бесконечные комбинации рецепторов, которые могут связывать уникальные антигены1. Этот процесс, называемый рекомбинацией V(D)J, включает в себя перегруппировки различных переменных (V), разнообразия (D) и соединения (J) генов, сопровождающиеся случайными делециями и вставками нуклеотидов в соединения2.
Архитектура адаптивной иммунной системы интересует ученых в разных областях на протяжении многих десятилетий. В прошлом секвенирование Сэнгера, комплементарное определение области 3 (CDR3) спектротипирование и проточная цитометрия использовались для характеристики иммунного репертуара, но обеспечивали низкое разрешение. В последнее десятилетие достижения в методах секвенирования следующего поколения (NGS) позволили глубоко понять характеристики и состав репертуаров TCR и BCR человека3,4. Эти высокопроизводительные системы (HTS) последовательно и обрабатывают миллионы перестроенные продукты TCR или BCR одновременно и позволяют проводить анализ с высоким разрешением конкретных Т- и В-клеток на уровне нуклеотидов или аминокислот. NGS предоставляет новую стратегию для изучения иммунного репертуара как в здоровье, так и в болезни. Исследования с использованием HTS продемонстрировали измененные репертуары TCR и BCR при аутоиммунных заболеваниях5,первичных иммунодефициозах6,7и злокачественных новообразованиях, таких как острый миелоидный лейкоз8. Используя NGS, мы и другие показали олигоклональное расширение специфических Т- и В-клеточных клонов у пациентов с воспалительным заболеванием кишечника (ВЗК), включая язвенный колит и болезнь Крона9,10,11,12,13,14. В целом, исследования из разных областей показывают, что изменения в репертуаре играют решающую роль в патогенезе иммуноопосредованных расстройств.
Текущий протокол описывает метод выделения ДНК из биопсии кишечника и крови, генерацию библиотек TCRβ и IGH PCR для NGS и выполнение секвенирования. Мы также предоставляем основные этапы анализа данных иммунного репертуара. Этот протокол также может применяться для генерации библиотек TCRα, TCRγ и IGL. Метод также совместим с другими органами (например, лимфатическими узлами, опухолями, синовиальной жидкостью, жировой тканью и т. д.), если используются тканеспецифические протоколы пищеварения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изменения в обилии и функции В- и Т-лимфоцитов часто встречаются при различных злокачественных новообразованиях18,хронических воспалительных заболеваниях (например, язвенном колите и ревматоидном артрите)10,19,а при различных иммунодефицита?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
никакой.
Materials
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
References
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
- Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
- Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
- Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
- Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
- Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
- Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn’s Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
- Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
- Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
- Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn’s disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
- Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn’s and Colitis. , (2019).
- Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn’s disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
- Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
- H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
- Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
- Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
- Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
- Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
- Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
- Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
- Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
- Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
- Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
- De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
- Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
- Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).
