차세대 시퀀싱을 이용한 T 및 B 세포 수용체 면역 레퍼토리 분석
Summary
현재 프로토콜은 혈액 샘플 및 장 생검에서 DNA 절연을 위한 방법을 설명합니다, 차세대 시퀀싱을 위한 TCRβ 및 IGH PCR 라이브러리의 생성, NGS 실행의 성능 및 기본 데이터 분석.
Abstract
적응력의 특징인 면역력은 T와 B 림프구에 의해 오케스트레이션됩니다. 순환 및 상이한 장기에서는 수십억 개의 고유한 T 및 B 세포 클론이 있으며, 각각 특정 항원을 결합하여 증식, 분화 및/또는 사이토카인 분비로 이어질 수 있습니다. T와 B 세포에 있는 광대한 이질성은 다른 유전 세그먼트의 무작위 재조합에 의해 생성됩니다. 지난 10년간 개발된 차세대 시퀀싱(NGS) 기술은 T 및 B 세포 수용체 면역 레퍼토리에 대한 전례 없는 심층뷰를 가능하게 합니다. 다양한 염증 성 조건, 면역 결핍, 감염 및 악성 종양에 대한 연구는 다른 장애에서 적응 성 면역 반응의 역할에 대한 중요한 통찰력을 제공, 면역 레퍼토리의 복제, 유전자 사용 및 생물 학적 특성에 현저한 변화를 보여 주었다.
여기에서, 우리는 혈액과 조직에서 T와 B 세포의 면역 레퍼토리의 NGS를 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 라이브러리 준비를 통해 DNA 격리에서 시작하여 NGS 시퀀서에 대한 시퀀싱및 기본 분석으로 끝나는 파이프라인을 제공합니다. 이 방법은 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 특정 T 및 B 세포의 탐사를 가능하게 하고, 따라서 다른 질병에 있는 림프구 인구 및 다양성 매개변수에 있는 동적 변경을 확인할 수 있습니다. 이 기술은 천천히 임상 사례를 입력하고 새로운 바이오 마커의 식별을위한 잠재력을 가지고, 위험 계층화 및 정밀 의학.
Introduction
T와 B 림프구로 구성된 적응형 면역 계통은 면역 학적 기억을 활용하여 이전에 만난 항원을 인식하고 신속한 반응을 시작합니다. 림프구는 골수에서 생성되고 흉선 (T 세포) 또는 골수 (B 세포)에서 성숙합니다. T 세포 수용체(TCR) 및 BCR(BCR) 둘 다 특정 항원인식을 허용하는 독특한 구성을 표시합니다. 항상성에서, T와 B 세포는 항원 제시 세포에 제시된 다른 펩티드의 수조를 끊임없이 순환하고 조사합니다. TCR 또는 BCR 결찰은 적절한 동자극과 함께, 세포 활성화로 이어지며, 그 결과 세포비콘 분비, 복제 팽창 및 항체의 생성을 초래하여 B 세포의 경우.
다른 T 또는 B 세포의 거대한 배열은 집합적으로 면역 레퍼토리라고, 다른 전형의 수많은 인식을 가능하게. 이러한 광대한 레퍼토리를 생성하기 위해, 다른 유전자 세그먼트의 임의 조립의 복잡한 과정이 발생, 독특한 항원1을결합 할 수있는 수용체의 거의 끝없는 조합을 생성. V(D)J 재조합이라고 하는 이 과정은접합부 2에서임의 삭제 및 뉴클레오티드 삽입과 함께 상이한 변수(V), 다양성(D) 및 결합(J) 유전자의 재배열을 포함한다.
적응형 면역 계통의 건축은 수십 년 동안 다른 필드에 있는 관심 있는 과학자가 있습니다. 과거에는 Sanger 시퀀싱, 보완적 결정 영역 3(CDR3) 스펙트럼, 및 유류 세포측정제가 면역 레퍼토리를 특성화하는 데 사용되었지만 낮은 해상도를 제공하였다. 지난 10년 동안 차세대 시퀀싱(NGS) 방법의 발전은 개인의 TCR 및 BCR 레퍼토리3,4의특성 과 구성에 대한 심층적인 통찰력을 가능하게 하였다. 이러한 고처리량 시스템(HTS) 서열 및 수백만 개의 재배열된 TCR 또는 BCR 제품을 동시에 처리하고 뉴클레오티드 또는 아미노산 수준에서 특정 T 및 B 세포의 고해상도 분석을 허용한다. NGS는 건강과 질병 모두에서 면역 레퍼토리를 연구하는 새로운 전략을 제공합니다. HTS를 이용한 연구는 자가면역 질환5,1차 면역결핍6,7,및 악성 종양학에서 의한 변경된 TCR 및 BCR 레퍼토리를 보여주었다8. NGS를 사용하여, 우리 및 그 외는 궤양성 대장염 및 크론병9,10,11,12,13,14를포함하여 염증성 장 질환 (IBD)을 가진 환자에서 특정 T 및 B 세포 클론의 올리고클론 확장을보여주었습니다. 전반적으로, 다른 필드에서 연구 결과는 레퍼토리에 있는 변경이 면역 매개 무질서의 병기에 있는 중요한 역할이 있다는 것을 건의합니다.
현재 프로토콜은 장 생검과 혈액에서 DNA의 격리를 위한 방법, NGS를 위한 TCRβ 및 IGH PCR 라이브러리의 생성, 그리고 시퀀싱 실행의 성능을 설명합니다. 우리는 또한 면역 레퍼토리 데이터 분석의 기본 단계를 제공합니다. 이 프로토콜은 TCRα, TCRγ 및 IGL 라이브러리의 생성에도 적용될 수 있다. 이 방법은 조직별 소화 프로토콜이 사용되는 한 다른 장기(예: 림프절, 종양, 활액, 지방 조직 등)와도 호환됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
B와 T 림프구의 풍부함과 기능의 변화는 종종 다른악성(18),만성 염증장애(예를 들어, 궤양성 대장염 및 류마티스 관절염)10,19,및 다양한 면역결핍(17,20)에서종종 발생한다. 현재 방법은 NGS를 활용하여 TCR 및 BCR 레퍼토리의 심층적 시각을 용이하게 하여 T 및 B 세포 클론의 미묘한 변화, 클론 공?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
없음.
Materials
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
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