Analyse du répertoire immunitaire des récepteurs des lymphocytes T et B à l’aide du séquençage de nouvelle génération
Summary
Le protocole actuel décrit une méthode d’isolement de l’ADN à partir d’échantillons de sang et de biopsies intestinales, la génération de bibliothèques de PCR TCRβ et IGH pour le séquençage de nouvelle génération, la performance d’une exécution NGS et l’analyse de données de base.
Abstract
La mémoire immunologique, caractéristique de l’immunité adaptative, est orchestrée par les lymphocytes T et B. Dans la circulation et les différents organes, il y a des milliards de clones uniques de cellules T et B, et chacun d’eux peut lier un antigène spécifique, menant à la prolifération, à la différenciation et/ou à la sécrétion de cytokine. La grande hétérogénéité des lymphocytes T et B est générée par la recombinaison aléatoire de différents segments génétiques. Les technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS), développées au cours de la dernière décennie, permettent une vue approfondie sans précédent du répertoire immunitaire des récepteurs des cellules T et B. Les études dans de diverses conditions inflammatoires, immunodéficits, infections et malignités ont démontré des changements marqués dans la clonalité, l’utilisation de gène, et les propriétés biophysiques du répertoire immunitaire, fournissant des informations importantes au sujet du rôle des immuno-réponses adaptatives dans différents désordres.
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour ngs du répertoire immunitaire des cellules T et B du sang et des tissus. Nous présentons un pipeline partant de l’isolement de l’ADN à travers la préparation de la bibliothèque, le séquençage sur séquenceur NGS et se terminant par des analyses de base. Cette méthode permet l’exploration de cellules T et B spécifiques au niveau des nucléotides ou des acides aminés, et peut ainsi identifier des changements dynamiques dans les populations de lymphocytes et les paramètres de diversité dans différentes maladies. Cette technique entre lentement dans la pratique clinique et a le potentiel d’identifier de nouveaux biomarqueurs, la stratification des risques et la médecine de précision.
Introduction
Le système immunitaire adaptatif, composé des lymphocytes de T et de B, utilise la mémoire immunologique pour identifier un antigène précédemment produit et lancer une réponse rapide. Les lymphocytes sont générés dans la moelle osseuse et mûrissent dans le thymus (lymphocytes T) ou la moelle osseuse (lymphocytes B). Le récepteur des lymphocytes T (TCR) et le récepteur des lymphocytes B (BCR) présentent des configurations uniques qui permettent la reconnaissance d’antigènes spécifiques. En homéostasie, les cellules T et B circulent constamment et enquêtent sur les billions de peptides différents présentés sur les cellules présentatrices d’antigènes. La ligature TCR ou BCR d’un antigène spécifique avec une forte affinité, ainsi qu’une costimulation appropriée, conduit à l’activation cellulaire, entraînant la sécrétion de cytokines, l’expansion clonale et la génération d’anticorps, dans le cas des cellules B.
L’énorme éventail des différents lymphocytes T ou B est collectivement appelé répertoire immunitaire, permettant la reconnaissance d’innombrables épitopes différents. Afin de générer un répertoire aussi vaste, un processus complexe d’assemblage aléatoire de différents segments de gènes a lieu, créant des combinaisons presque infinies de récepteurs qui peuvent lier des antigènes uniques1. Ce processus, appelé recombinaison V(D)J, comprend des réarrangements de différentes variables (V), diversités (D) et gènes de jonction (J), accompagnés de délétions aléatoires et d’insertions de nucléotides dans les jonctions2.
L’architecture du système immunitaire adaptatif intéresse les scientifiques dans différents domaines depuis de nombreuses décennies. Dans le passé, l’ordonnancement de Sanger, le spectratyping déterminant complémentaire de la région 3 (CDR3), et la cytométrie d’écoulement ont été utilisés pour caractériser le répertoire immunisé, mais ont fourni la basse résolution. Au cours de la dernière décennie, les progrès réalisés dans les méthodes de séquençage de nouvelle génération (NGS) ont permis de mieux comprendre les caractéristiques et la composition des répertoires TCR et BCR d’un individu3,4. Ces systèmes à haut débit (HTS) séquencent et traitent des millions de produits TCR ou BCR réarrangés simultanément et permettent une analyse à haute résolution de cellules T et B spécifiques au niveau des nucléotides ou des acides aminés. Ngs fournit une nouvelle stratégie pour étudier le répertoire immunitaire dans la santé et la maladie. Les études utilisant HTS ont démontré des répertoires altérés de TCR et de BCR dans les maladies autoimmunes5,les immunodéficits primaires6,7,et les malignités, telles que dans la leucémie myéloïde aiguë8. En utilisant NGS, nous et d’autres avons montré l’expansion oligoclonale de clones spécifiques de cellules T et B, dans les patients présentant la maladie intestinale inflammatoire (MII), y compris la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn9,10,11,12,13,14. De façon générale, les études de différents domaines suggèrent que les changements du répertoire aient un rôle crucial dans la pathogenèse des troubles à médiation immunitaire.
Le protocole actuel décrit une méthode d’isolement de l’ADN à partir de biopsies intestinales et de sang, la génération de bibliothèques de PCR TCRβ et IGH pour ngs, et la performance de l’exécution de séquençage. Nous fournissons également des étapes de base dans l’analyse des données du répertoire immunitaire. Ce protocole peut également être appliqué pour la génération de bibliothèques TCRα, TCRγ et IGL. La méthode est également compatible avec d’autres organes (p. ex. ganglions lymphatiques, tumeurs, liquide synovial, tissu adipeux, etc.) tant que des protocoles de digestion spécifiques aux tissus sont utilisés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des changements dans l’abondance et la fonction des lymphocytes B et T sont souvent rencontrés dans différentes malignités18, troubles inflammatoires chroniques (par exemple, colite ulcéreuse et polyarthrite rhumatoïde)10,19, et dans diverses immunodéficiences17,20. La méthode actuelle utilise NGS pour faciliter une vue approfondie des répertoires de TCR et de BCR, permet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
aucun.
Materials
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
References
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