腸内ビリ上皮によるオルガノイドの3D培養
Summary
この手順は、脱分化を受けているマウス腸管上皮からの絨毛の分離を記述し、そのオルガノイド形成電位を決定する。
Abstract
腸上皮由来のオルガノイドのクロノジェニック性は、その中に幹細胞が存在することに起因する。マウスの小腸上皮は、陰窩および絨毛に区分される:茎および増殖細胞は、陰窩に閉じ込められるのに対し、絨毛上皮は分化した細胞のみを含む。したがって、正常な腸内窩は、絨毛ではなく、3D培養でオルガノイドを生じさせることができる。ここで説明する手順は、茎につながる脱分化を受けているvillus上皮にのみ適用可能である。記載された方法は、Smad4-機能喪失:β-カテニン機能の利得(Smad4KO:β-カテニンGOF)条件変異マウスを使用する。この突然変異は、腸内絨毛を分解し、絨毛内に幹細胞を生成させる。脱分化を受けた腸絨毛は、ガラススライドを使用して腸から掻き取られ、70μmのストレーナーに入れられ、BME-R1マトリックスでめっきする前に緩い細胞またはクリプトを濾過してオルガノイド形成の可能性を決定するために数回洗浄される。得られたオルガノイドが、3Dマトリックスでめっきする前後の両方で、単一の絨毛の欠如を確実にするために、分離された絨毛を顕微鏡的に評価し、絨毛からのオルガノイド発達の時間経過を監視する2つの主な基準を使用した。絨毛からのオルガノイド開始は、めっき後2〜5日後に起こり、不規則な形で現れるのに対し、同じ腸上皮由来の陰窩由来のオルガノイドはめっきの16時間以内に明らかであり、球状に見える。しかし、この方法の制限は、オルガノイドが形成される数、およびビリからのオルガノイド開始に要する時間が、脱分化の程度によって異なるためである。したがって、変異の特異性または脱分性を引き起こす侮辱に応じて、ビリがそれらのオルガノイド形成電位をアッセイするために収穫できる最適な段階は、経験的に決定されなければならない。
Introduction
腸内の納骨堂は絨毛ではなく、マトリゲルまたはBME-R1マトリックスで培養するとオルガノイドを形成する。これらのオルガノイドは自己組織化構造であり、生体内の腸上皮に存在する種々の分化系統、前駆細胞、および幹細胞の存在に起因してしばしば「ミニ腸」と呼ばれる。クリプトからオルガノイドを形成する可能性は、幹細胞1の存在に起因する。一方、腸内絨毛は分化した細胞のみで構成されており、オルガノイドを形成することはできません。しかし、突然変異2または絨毛上皮の脱分化を可能にする条件は、絨毛2、3の幹細胞を引き起こし得る。この絨毛上皮の幹形成をもたらすこの運命変化は、3Dマトリックスで脱分性性のヴィルス上皮をめっきし、絨毛上皮における脱ノボ茎の指標としてそのオルガノイド形成電位を決定することによって確認することができる。したがって、この手順の重要な側面は、暗号汚染の欠如を確実にすることです。
Smad4KO:β-カテニンGOF 条件突然変異は、絨毛における増殖および幹細胞マーカーの発現によって特徴づけられる腸上皮における脱分化を引き起こす、 そして最終的に異所性陰窩と呼ばれる絨毛の陰窩様構造の形成 これらの分化された絨毛は、異所性の陰窩(in vivo)における幹細胞マーカーの発現と、オルガノイドwhを形成する変異絨毛の能力によって決定されたエンメッキマトリゲル3.以下に挙げた手順は、Smad4KOにおける腸上皮の変性性を確認するために用いられる方法論を詳述する:β-カテニンGOF 変異マウス。絨毛を単離するためのこの方法論の主な特徴は、EDTAキレート法4とは対照的に、腸管腔の掻き取りの使用であった。EDTAキレート法とは異なり、掻き取りによる絨毛分離は、基礎となる間質の大部分を保持し、つながれた納骨堂なしで絨毛を生み出すために擦り傷の圧力を調整することを可能にする。削りの圧力はオペレータに主観的であるため、納骨堂なしで絨毛を生み出す最適な圧力は、オペレータによって経験的に決定されなければならない。この手順の重要な側面は、BME-R1マトリックスでめっき前後の絨毛の顕微鏡検査による暗号汚染の欠如を確実にすることです。
腸絨毛は、ガラススライドで腸内腔を削り取り、70μmのフィルターに入れ、PBSで洗浄して、BME-R1マトリックスでめっきする前に緩い細胞またはクリプトを取り除きます。この方法は、クリリが最も長い十二指腸の近位半分を収穫する絨毛を閉じ込め、b)絨毛を収穫するスクラップの数を最小限に抑え、c)6ウェル皿の中で一連のPBSを通して絨毛を含むフィルターを洗浄し、d)顕微鏡検査前およびRMEマトリックスの後にクリプト汚染の欠如を確認する。EDTAキレートではなく擦り傷によるVilli単離は、必要に応じて、絨毛上皮からのオルガノイド開始のためのニッチ信号5、6、7、8を提供し得る根底の間質の完全な損失を防ぐ。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法は、生体内で幹細胞マーカーを取得する不分化ビリ上皮の自己再生能力を確認できる。正常な腸上皮は、陰窩内に幹細胞が存在するため3Dで培養した場合、陰窩からオルガノイドを生じさせることができるが、絨毛コンパートメントからは生じることができない。したがって、3D培養で培養したデファノイド絨毛上皮からオルガノイド形成は、細胞運命逆転か…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本書は、NIH国立がん研究所の賞番号K22 CA218462-03によって支援されました。R-Spondin1を発現するHEK293-T細胞は、マイケル・P・ヴェルジ博士からの寛大な贈り物でした。
Materials
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
References
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