Organoidlerin Bağırsak Villi Epitelinden 3D Kültasyonu Adanmışlık Geçiriyor
Summary
Prosedür, villinin organoid şekillendirme potansiyellerini belirlemek için adanmışlık geçiren fare bağırsak epitelinden izolasyonunu açıklar.
Abstract
Organoidlerin bağırsak epitelinden klonojenikliği, buradaki kök hücrelerin varlığına atfedilir. Fare küçük bağırsak epitelleri mahzenlere ve villilere bölünür: kök ve çoğalan hücreler mahzenlerle sınırlıdır, villi epitel ise sadece farklılaştırılmış hücreler içerir. Bu nedenle, normal bağırsak mahzenleri, ancak villi değil, 3D kültürlerde organoidlere yol açabilir. Burada açıklanan prosedür sadece saplılığa yol açan ayırıcılık geçiren villus epitel için geçerlidir. Açıklanan yöntem, Smad4-fonksiyon kaybı:β-catenin fonksiyon kazancı (Smad4KO:β-cateninGOF)koşullu mutant faresini kullanır. Mutasyon, bağırsak villisinin villide kök hücreleri adamasına ve üretmesine neden olur. Adanmışlık geçiren bağırsak villisi, cam slaytlar kullanılarak bağırsaktan kazınır, 70 μm’lik bir süzgeçe yerleştirilir ve organoid oluşturma potansiyellerini belirlemek için BME-R1 matrisinde kaplamadan önce gevşek hücreleri veya mahzenleri filtrelemek için birkaç kez yıkanır. Elde edilen organoidlerin şifrelerden değil, ayırıcı villus bölmesinden geliştirilmesini sağlamak için iki ana kriter kullanılmıştır: 1) 3D matriste kaplamadan önce ve sonra bağlı herhangi bir mahzenin olmamasını sağlamak için izole edilmiş villinin mikroskobik olarak değerlendirilmesi ve 2) villiden organoid gelişiminin seyrini izlemek. Villiden organoid inisiyonu kaplamadan sadece iki ila beş gün sonra gerçekleşir ve düzensiz şekilli görünürken, aynı bağırsak epitelinden elde edilen kripto kökenli organoidler kaplamadan sonraki on altı saat içinde belirgindir ve küresel görünür. Bununla birlikte, yöntemin sınırlaması, oluşan organoid sayısının ve villiden organoid başlatma için gereken sürenin, ayırma dereceine bağlı olarak değişmesidir. Bu nedenle, mutasyonun özgüllüğüne veya adanmışlığa neden olan hakarete bağlı olarak, villi’nin organoid şekillendirme potansiyellerini test etmek için hasat edilebileceği en uygun aşama ampirik olarak belirlenmelidir.
Introduction
Bağırsak mahzenleri ama villi değil, Matrigel veya BME-R1 matrisinde kültürlendiğinde organoidler oluşturur. Bu organoidler, bağırsak epitel in vivosunda bulunan çeşitli farklılaşmış soyların, ataların ve kök hücrelerin varlığı nedeniyle genellikle “mini bağırsak” olarak adlandırılan kendi kendini organize eden yapılardır. Kriptolardan organoid oluşturma potansiyeli kök hücrelerin varlığına atfedilir1. Öte yandan bağırsak villi sadece farklılaştırılmış hücrelerden oluşur ve bu nedenle organoid oluşturamaz. Bununla birlikte, mutasyonlar2 veya villus epitelinin tahsis edilmesine izin veren durumlar villi2,3‘te kök hücrelere yol açabilir. Villi epitelde saplanma ile sonuçlanan bu kader değişikliği, villus epitelinde de-novo saplanma göstergesi olarak organoid oluşturma potansiyellerini belirlemek için 3D matriste ayırıcı villus epitelinin kaplanmasıyla doğrulanabilir. Bu nedenle, bu prosedürün kritik yönü, mahzen kirlenmesinin olmamasını sağlamaktır.
Smad4KO:β-cateninGOF koşullu mutasyonu, villide çoğalma ve kök hücre belirteçlerinin ekspresyumu ile işaretlenen bağırsak epitelinde farklılaşmaya neden olur, ve sonunda ektopik kriptolar olarak adlandırılan villide şifreli benzeri yapıların oluşumu Bu adanmış villi kök hücrelerin varlığı, ektopik mahzenlerdeki kök hücre belirteçlerinin ekspresyözü (in vivo) ve mutant villinin organoidleri oluşturma yeteneği ile belirlendi. en kaplama Matrigel3. Aşağıda belirtilen prosedür, Smad4 KO:β-cateninGOF mutant farelerinde ayırıcı bağırsakepitelinin sapını doğrulamak için kullanılan metodolojiyi detaylandırır. Villi izole etmek için bu metodolojinin önemli bir özelliği, EDTA şelasyon yönteminin aksine bağırsak lümeninin kazınmasıydı4. EDTA şelasyon yönteminin aksine, kazıyarak villi izolasyonu alttaki mezenkimin çoğunu korur ve kazıma basıncını bağlı mahzenler olmadan villi vermek için ayarlamaya izin verir. Kazıma basıncı operatöre özneldir, bu nedenle, şifreli bağlı olmadan villi vermek için en uygun basınç operatör tarafından ampirik olarak belirlenmelidir. Bu prosedürün kritik yönü, Villi’nin BME-R1 matrisinde hem kaplamadan önce hem de sonra mikroskobik incelemesi ile kripto kontaminasyonunun olmamasını sağlamaktır.
Bağırsak villisi, bme-R1 matrisinde kaplamadan önce, varsa gevşek hücrelerden veya mahzenlerden kurtulmak için bağırsak lümenini cam slaytlarla kazınır ve 70 μm filtreye yerleştirilir ve PBS ile yıkanır. Yöntem, kripto kontaminasyonunu önlemek için aşağıdaki kriterlere vurgular: a) villinin en uzun olduğu duodenumun proksimal yarısının villi hasadını sınırlamak, b) villi-verimli sıyrıkların sayısını en aza indirmek, c) Villi içeren filtrenin altı kuyulu bir tabakta bir dizi PBS aracılığıyla yıkanması ve d) BME-R1 matrisinde kaplamadan önce ve sonra mikroskobik inceleme ile kripto kontaminasyonunun olmamasını onaylamak. EDTA şelasyonu yerine kazınarak villi izolasyon, villus epitelinden organoid başlatma içingerekirse 5,6,7,8niş sinyallerini sağlayabilecek alttaki mezenkimenin tamamen kaybını önler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntem, kök hücre belirteçlerini in vivo edinen villi epitelin farklılaşma kapasitesini doğrulayabilir. Normal bağırsak epitelleri, mahzende kök hücrelerin varlığı nedeniyle 3D olarak kültürlendiğinde, vizipten organoidlere yol açabilir, ancak villi bölmesine yol açamaz1. Bu nedenle, 3D kültürlerde kültüre edilen farklılaşmış villi epitelden organoid oluşumu, hücre kaderinin tersine dönmesinden kök hücre oluşumunu doğrular. Mutasyonlardan ve/veya yara…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yayın NIH Ulusal Kanser Enstitüsü’nden K22 CA218462-03 ödül numarası ile desteklendi. R-Spondin1’i ifade eden HEK293-T hücreleri Dr. Michael P. Verzi’nin cömert bir hediyesiydi.
Materials
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Schwitalla, S., et al. Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties. Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).
- Perekatt, A. O., et al. SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium. 癌症研究. 78 (17), 4878-4890 (2018).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).
- Aoki, R., et al. Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).
- Seiler, K. M., et al. Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage. Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).
- Stzepourginski, I., et al. CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).
- Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Madison, B. B., et al. Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis. Development. 132 (2), 279-289 (2005).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
- Baulies, A., et al. The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages. Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).
- Zeilstra, J., et al. Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling. Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2. Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).
- Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes. Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).
- Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).
- Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine. PLoS One. 8 (1), 54757 (2013).
- Stringer, E. J., et al. Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm. Development. 139 (3), 465-474 (2012).
