장내 빌리 상피에서 오르가노이드의 3D 배양
Summary
절차는 그들의 오르가노이드 형성 잠재력을 결정하기 위하여 변태를 겪고 있는 마우스 상피에서 융모의 격리를 기술합니다.
Abstract
장 상피에서 유기체의 clonogenicity는 그 안에 줄기 세포의 존재에 기인한다. 마우스 작은 장 상피는 지하실과 사악으로 구획된다 : 줄기와 증식 세포는 지하실에 국한된 반면, 사악한 상피는 분화 된 세포만 포함합니다. 따라서, 정상적인 장 지하실, 하지만 villi, 3D 문화권에서 오르가노이드를 초래할 수 있습니다. 여기에 설명된 절차는 줄기로 이끌어 내는 무관심을 겪고 있는 상피상에만 적용됩니다. 설명된 방법은 Smad4-loss-of-function:β-카테닌 게인-기능(Smad4KO:β-카테닌GOF)조건부 돌연변이 마우스를 사용한다. 돌연변이는 사순에서 줄기 세포를 분화하고 생성하는 장 빌리를 일으키는 원인이 됩니다. 비차별화를 겪고 있는 장 내 의 빌리는 유리 슬라이드를 사용하여 장에서 긁어 내고, 70 μm 스트레이너에 배치하고 BME-R1 매트릭스에서 도금하기 전에 느슨한 세포 나 토굴을 걸러 내어 오르노이드 형성 잠재력을 결정합니다. 두 가지 주요 기준은 생성된 오르가노이드가 암호가 아닌 분산 된 빌루스 구획에서 개발되었는지 확인하는 데 사용되었습니다 : 1) 3D 매트릭스에서 도금 전후의 테더드 토굴의 부재를 보장하기 위해 고립 된 비방을 현미경으로 평가하고, 2) 빌리에서 오르가노이드 개발 과정을 모니터링. 빌리에서 유기성 개시는 도금 후 2 ~ 5 일 만 발생하고 불규칙한 모양으로 나타납니다, 같은 장 상피에서 crypt 유래 오르가노이드는 도금의 16 시간 이내에 명백하고 구형 나타납니다. 그러나 이 방법의 한계는 형성된 오르가노이드의 수와 비리로부터의 오르가노이드 개시에 필요한 시간은 비차별화 정도에 따라 달라지므로 이다. 따라서, 돌연변이의 특이성 또는 비차별화를 일으키는 모욕에 따라, 그들의 오르가노이드 형성 잠재력을 분석하기 위하여 빌리를 수확할 수 있는 최적 단계는 경험적으로 결정되어야 합니다.
Introduction
장 내 지하실은 빌리가 아니라, Matrigel 또는 BME-R1 매트릭스에서 배양 할 때 오르가노이드를 형성합니다. 이러한 오르가노이드는 생체 내 장 상피에 존재하는 다양한 분화 계보, 선조 및 줄기 세포의 존재로 인해 종종 “미니 창자”라고도 하는 자가 조직 구조입니다. 토굴에서 오르가노이드를 형성 할 수있는 잠재력은 줄기 세포1의존재에 기인한다. 반면에 장 내 빌리는 분화 된 세포로만 구성되므로 오르가노이드를 형성 할 수 없습니다. 그러나, 돌연변이2 또는 빌루스 상피의 비차별화를 허용하는 조건은 빌리2,3에서줄기 세포로 이어질 수 있다. 이 운명의 변화는 3D 매트릭스에서 차별화된 빌루스 상피를 도금하여 그들의 오르가노이드 형성 잠재력을 골라서 알루루스 에피테륨의 탈노보 줄기의 지표로서 확인할 수 있다. 따라서 이 절차의 중요한 측면은 토굴 오염이 없는지 확인하는 것입니다.
Smad4KO:β-카테닌GOF 조건부 돌연변이는 빌리에서 증식 및 줄기 세포 마커의 발현에 의해 표시된 장 상피에서 차별성을 유발하며, 그리고 결국 자궁 외토로 지칭되는 빌리에서 토굴과 같은 구조물의 형성이 이러한 분리된 빌리의 존재는 자궁 내 의 줄기 세포 마커의 발현(byvivo)과가구형 을 형성하는 돌연변이 빌리의 능력에 의해 결정되었다. en 도금 된 마트리겔3. 앞서 언급한 절차는 Smad4 KO:β-카테닌GOF 돌연변이 마우스에서 차별화된 장 상피의줄기를 확인하는 데 사용되는 방법론을 정교하게 설명합니다. 비방을 격리하기 위한 이 방법론의 주요 특징은 EDTA 킬레이션 방법4와는 반대로 장 루멘의 긁어내는 사용이었습니다. EDTA 킬레이션 방법과 달리 긁어내면 비방 격리는 기본 메센치메의 대부분을 유지하고 테더링 된 토굴없이 비방을 생성하도록 긁는 압력을 조정할 수 있습니다. 스크래핑의 압력은 작업자에게 주관적이기 때문에 스테인드 없이 비방을 산출하는 최적의 압력은 작업자에 의해 경험적으로 결정되어야 합니다. 이 절차의 중요한 측면은 BME-R1 매트릭스에서 도금 전후에 모두 villi의 현미경 검사에 의해 토굴 오염의 부재를 보장하는 것입니다.
장 내 빌리는 유리 슬라이드로 장 루멘을 긁어 내고 70 μm 필터에 배치하고 PBS로 세척하여 BME-R1 매트릭스에서 도금하기 전에 느슨한 세포 또는 토굴을 제거합니다. 방법은 지하실 오염을 방지하기 위해 다음과 같은 기준에 강조 : a) 빌리가 가장 긴 십이지장의 근위 절반을 수확 하도록, b) 사악한 항복 긁힌 자국의 수를 최소화하고, c) 6웰 접시에서 일련의 PBS를 통해 빌리를 함유하는 필터를 세척하고, d) BME-R1 매트릭스에서 도금 전후현미경 검사에 의한 토굴 오염의 부재를 확인한다. EDTA 킬레이션이 아닌 긁어내어 빌리 격리는, 빌루스 상피로부터 의유기 개시를 위해, 필요한 경우 틈새 신호5,6,7,8을제공할 수 있는 근본적인 메센치움의 완전한 손실을 방지한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법은 생체 내에서 줄기 세포 마커를 획득하는 비차별화 된 악성 상피의 자체 갱신 능력을 확인할 수 있습니다. 일반적인 장 상피는 토굴1에서줄기 세포의 존재때문에 3D로 배양 할 때 지하실에서 오르가노이드를 발생시키지만 빌리 컴파트먼트는 발생할 수 있습니다. 따라서, 3D 배양에서 배양된 탈분화된 빌리 상피로부터의 오르간구형 형성은 세포 운명 반전으로부터…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 간행물은 NIH 국립 암 연구소에서 상 번호 K22 CA218462-03에 의해 지원되었다. R-Spondin1을 표현하는 HEK293-T 세포는 마이클 P. 베르지 박사의 관대한 선물이었습니다.
Materials
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
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