3D-Kultivierung von Organoiden aus dem intestinalen Zottenepithel, das einer Dedifferenzierung unterzogen wird
Summary
Das Verfahren beschreibt die Isolierung der Zotten aus dem Darmepithel der Maus, die einer Dedifferenzierung unterzogen werden, um ihr organoidbildendes Potenzial zu bestimmen.
Abstract
Die Klonogenität von Organoiden aus dem Darmepithel wird auf das Vorhandensein von Stammzellen darin zurückgeführt. Das Dünndarmepithel der Maus ist in Krypten und Zotten unterteilt: Die Stamm- und Proliferationszellen sind auf die Krypten beschränkt, während das Zottenepithel nur differenzierte Zellen enthält. Daher können die normalen Darmkrypten, aber nicht die Zotten, in 3D-Kulturen organoide entstehen. Das hier beschriebene Verfahren ist nur auf Zottenepithel anwendbar, das einer Dedifferenzierung unterzogen wird, die zu Stielbildung führt. Die beschriebene Methode verwendet die Smad4-loss-of-function:β-catenin gain-of-function (Smad4 KO:β-cateninGOF)bedingte mutierte Maus. Die Mutation bewirkt, dass die Darmzotten dedifferenzieren und Stammzellen in den Zotten erzeugen. Darmzotten, die einer Dedifferenzierung unterzogen werden, werden mit Glasobjektträgern vom Darm abgekratzt, in ein 70 μm-Sieb gelegt und mehrmals gewaschen, um lose Zellen oder Krypten herauszufiltern, bevor sie in die BME-R1-Matrix einplattiert werden, um ihr organoidbildendes Potenzial zu bestimmen. Zwei Hauptkriterien wurden verwendet, um sicherzustellen, dass die resultierenden Organoide aus dem entdifferenzierenden Zottenkompartiment und nicht aus den Krypten entwickelt wurden: 1) mikroskopische Bewertung der isolierten Zotten, um sicherzustellen, dass keine angebundenen Krypten sowohl vor als auch nach der Beschichtung in der 3D-Matrix vorhanden sind, und 2) Überwachung des zeitliche Verlaufs der Organoidentwicklung aus den Zotten. Die organoide Initiation aus den Zotten erfolgt nur zwei bis fünf Tage nach dem Plattieren und erscheint unregelmäßig geformt, während die aus der Krypta abgeleiteten Organoide aus demselben Darmepithel innerhalb von sechzehn Stunden nach der Beschichtung sichtbar sind und kugelförmig erscheinen. Die Einschränkung der Methode besteht jedoch darin, dass die Anzahl der gebildeten Organoide und die Zeit, die für die Organoidinitiierung aus den Zotten benötigt wird, je nach Grad der Dedifferenzierung variieren. Abhängig von der Spezifität der Mutation oder der Beleidigung, die die Dedifferenzierung verursacht, muss daher das optimale Stadium, in dem Zotten entnommen werden können, um ihr organoidales Bildungspotenzial zu bestimmen, empirisch bestimmt werden.
Introduction
Die Darmkrypten, aber keine Zotten, bilden Organoide, wenn sie in Matrigel oder BME-R1-Matrix kultiviert werden. Diese Organoide sind selbstorganisierende Strukturen, die oft als “Mini-Darm” bezeichnet werden, da die verschiedenen differenzierten Linien, Vorläufer- und Stammzellen im Darmepithel in vivovorhanden sind. Das Potenzial, Organoide aus Krypten zu bilden, wird auf das Vorhandensein von Stammzellenzurückgeführt 1. Die Darmzotten hingegen bestehen nur aus differenzierten Zellen und können daher keine Organoide bilden. Mutationen 2 oderZustände, die eine Dedifferenzierung des Zottenepithels ermöglichen, können jedoch zu Stammzellen in den Zotten2,3führen. Diese Schicksalsänderung, die zu einer Stängelbildung im Zottenepithel führt, kann durch Beschichtung des dedifferenzierenden Zottenepithels in 3D-Matrix bestätigt werden, um ihr organoidbildendes Potenzial als Indikator für die De-novo-Stemness im Zottenepithel zu bestimmen. Daher besteht der kritische Aspekt dieses Verfahrens darin, sicherzustellen, dass keine Kryptenkontamination vorliegt.
Die Smad4KO:β-CateninGOF-bedingte Mutation verursacht eine Dedifferenzierung im Darmepithel, die durch die Expression von Proliferations- und Stammzellmarkern in den Zotten und schließlich die Bildung kryptenartiger Strukturen in den als ektopische Krypten bezeichneten Zotten gekennzeichnet ist Das Vorhandensein von Stammzellen, diese dedifferenzierten Zotten wurde durch die Expression von Stammzellmarkern in den ektopischen Krypten (in vivo) und die Fähigkeit der mutierten Zotten, Organoide zu bilden, bestimmt. en plattiert Matrigel3. Das unten erwähnte Verfahren erläutert die Methodik, die verwendet wird, um die Stammhaftigkeit des dedifferenzierenden Darmepithels in den Smad4KO:β-CateninGOF-mutierten Mäusen zu bestätigen. Ein Schlüsselmerkmal dieser Methodik zur Isolierung von Zotten war die Verwendung des Abkratzens des Darmlumens im Gegensatz zur EDTA-Chelatbildungsmethode4. Anders als bei der EDTA-Chelat-Methode behält die Zottenisolierung durch Abkratzen den Großteil des darunter liegenden Mesenchyms bei und ermöglicht es, den Abkratzdruck so einzustellen, dass Zotten ohne angebundene Krypten ergeben. Der Abkratzdruck ist für den Bediener subjektiv, daher muss der optimale Druck, Zotten ohne angebundene Krypten zu liefern, vom Bediener empirisch bestimmt werden. Der kritische Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, die Abwesenheit von Kryptenkontamination durch mikroskopische Untersuchung der Zotten sowohl vor als auch nach der Beschichtung in der BME-R1-Matrix sicherzustellen.
Darmzotten werden mit Glasobjektträgern vom Darmlumen abgekratzt und in einen 70 μm-Filter gegeben und mit PBS gewaschen, um lose Zellen oder Krypten, falls vorhanden, loszuwerden, bevor sie in die BME-R1-Matrix einplattiert werden. Die Methode betont die folgenden Kriterien, um eine Kryptenkontamination zu vermeiden: a) Eingrenzen der Zottenernte auf die proximale Hälfte des Zwölffingerdarms, wo die Zotten am längsten sind, b) Minimierung der Anzahl der Zotten-liefernden Kratzer, c) Waschen des Filters, der die Zotten enthält, durch eine Reihe von PBS in einer Sechs-Brunnen-Schüssel und d) Bestätigung des Fehlens einer Kryptakontamination durch mikroskopische Untersuchung vor und nach dem Plattieren in BME-R1-Matrix. Die Zottenisolierung durch Abkratzen und nicht durch EDTA-Chelatbildung verhindert den vollständigen Verlust des darunter liegenden Mesenchyms, das bei Bedarf die Nischensignale5,6,7,8für die Organoidinitiierung aus dem Zottenepithel liefern kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Methode kann die Selbsterneuerungsfähigkeit von dedifferenzierendem Zottenepithel bestätigen, das Stammzellmarker in vivo erwirbt. Das normale Darmepithel kann Organoide aus der Krypta, aber nicht aus dem Zottenkompartiment hervorbringen, wenn es in 3D kultiviert wird, da Stammzellen in den Krypten1vorliegen. So bestätigt die Organoidbildung aus dem in 3D-Kulturen kultivierten dedifferenzierten Zottenepithel die Stammzellbildung aus der Zellschicksalsumkehr. Berichte über die Um…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Publikation wurde durch die Award Number K22 CA218462-03 des NIH National Cancer Institute unterstützt. Die HEK293-T-Zellen, die R-Spondin1 exprimieren, waren ein großzügiges Geschenk von Dr. Michael P. Verzi.
Materials
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
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