قياس تدفق الدم الغريلي في قوقعة الفئران باستخدام نافذة الأوعية المفتوحة والمجهر الفلوري داخل الحيوية
Summary
يوفر نهج نافذة الأوعية المفتوحة باستخدام مقتفيات الفلورسنت دقة كافية لقياس تدفق الدم في القوقعة الصناعية (CoBF). تسهل هذه الطريقة دراسة التغيرات الهيكلية والوظيفية في CoBF في الفئران في ظل الظروف الطبيعية والمرضية.
Abstract
يتطلب نقل الصوت عملية التمثيل الغذائي ، والوظيفة الطبيعية للأوعية الدموية الدقيقة في الجدار الجانبي أمر بالغ الأهمية للحفاظ على إمكانات القوقعة الداخلية ، ونقل الأيونات ، وتوازن السوائل. تم الإبلاغ عن أشكال مختلفة من اضطرابات السمع تنطوي على دوران الأوعية الدقيقة غير الطبيعي في القوقعة. يعد التحقيق في كيفية تأثير أمراض تدفق الدم القوقعي (CoBF) على وظيفة السمع أمرا صعبا بسبب عدم وجود طرق استجواب مجدية وصعوبة الوصول إلى الأذن الداخلية. تم استخدام نافذة وعاء مفتوحة في جدار القوقعة الصناعية الجانبي ، جنبا إلى جنب مع المجهر الفلوري داخل الحيوية ، لدراسة تغيرات CoBF في الجسم الحي ، ولكن في الغالب في خنزير غينيا ومؤخرا فقط في الفأر. تصف هذه الورقة والفيديو المرتبط بها طريقة نافذة الأوعية المفتوحة لتصور تدفق الدم في قوقعة الفأر. وتشمل التفاصيل 1) إعداد تعليق خلايا الدم المسمى بالفلورسنت من الفئران. 2) بناء نافذة وعاء مفتوحة للفحص المجهري داخل الحيوية في فأر مخدر ، و 3) قياس سرعة تدفق الدم وحجمه باستخدام تسجيل غير متصل بالإنترنت للتصوير. يتم تقديم الطريقة في شكل فيديو لإظهار كيفية استخدام نهج النافذة المفتوحة في الماوس للتحقيق في التغيرات الهيكلية والوظيفية في دوران الأوعية الدقيقة للقوقعة الصناعية في ظل الظروف العادية والمرضية.
Introduction
تعد الوظيفة الطبيعية لدوران الأوعية الدقيقة في جدار القوقعة الصناعية الجانبي (الذي يضم غالبية الشعيرات الدموية في الرباط الحلزوني والأوعية الدموية المخططة) مهمة للغاية للحفاظ على وظيفة السمع1. CoBF غير طبيعي متورط في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من اضطرابات الأذن الداخلية بما في ذلك فقدان السمع الناجم عن الضوضاء ، واستسقاء الأذن ، و presbycusis2،3،4،5،6،7،8،9. سيمكن تصور CoBF داخل الحيوية من فهم أفضل للروابط بين وظيفة السمع وأمراض الأوعية الدموية القوقعية.
على الرغم من أن تعقيد القوقعة وموقعها داخل العظم الصدغي يحول دون التصور المباشر وقياس CoBF ، فقد تم تطوير طرق مختلفة لتقييم CoBF بما في ذلك قياس تدفق الدوبلر بالليزر (LDF) 10،11،12 ، التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) 13 ، المجهر الفلوري داخل الحيوية (FIVM) 14 ، التنظير المجهري الفلوري (FME) 15 ، التصوير بالأشعة بالليزر بالمنظار (LSCI)16 ، والنهج القائمة على حقن العلامات الموسومة والميكروسفير الموسوم إشعاعيا في مجرى الدم (تصوير الأوعية الدقيقة الضوئية، OMAG)17،18،19،20. ومع ذلك ، لم تمكن أي من هذه الطرق من التتبع المطلق في الوقت الفعلي للتغيرات في CoBF في الجسم الحي ، باستثناء FIVM. FIVM ، بالاقتران مع نافذة وعاء في جدار القوقعة الصناعية الجانبي ، هو نهج تم استخدامه والتحقق من صحته في خنزير غينيا في ظل ظروف تجريبية مختلفة من قبل مختبرات مختلفة14،21،22.
تم إنشاء طريقة FIVM بنجاح لدراسة التغيرات الهيكلية والوظيفية في دوران الأوعية الدقيقة القوقعة الصناعية في الفأر باستخدام فلوريسين إيزوثيوسيانات (FITC)-dextran كوسط تباين وصبغة فلورية – إما DiO (3 ، 3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate ، الأخضر) أو Dil (1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate ، red) – لوضع العلامات المسبقة على خلايا الدم ، وتصور الأوعية ، وتتبع سرعة تدفق الدم. في هذه الدراسة ، تم وصف بروتوكول هذه الطريقة للتصوير وتحديد التغيرات في CoBF في الفئران في ظل الظروف العادية والمرضية (مثل بعد التعرض للضوضاء). تمنح هذه التقنية الباحث الأدوات اللازمة للتحقيق في الآليات الأساسية ل CoBF المتعلقة بضعف السمع وعلم الأمراض في الأوعية الدموية stria ، خاصة عند تطبيقها بالاقتران مع نماذج الفئران المعدلة وراثيا المتاحة بسهولة.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه الورقة كيف يمكن تصور الشعيرات الدموية في الجدار الجانبي للقوقعة الصناعية (وفي ستريا والأوعية الدموية) لنموذج الفأر مع وضع العلامات الفلوروفورية في إعداد نافذة وعاء مفتوح تحت نظام FIVM. يستخدم نموذج الماوس على نطاق واسع ويفضل كنموذج للثدييات للتحقيق في صحة الإنسان ومرضه. البروتوكو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من قبل NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi) ، NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi) ، NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) ، ومؤسسة البحوث الطبية من جامعة أوريغون للصحة والعلوم (OHSU) (X.Shi).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
References
- Shi, X. Physiopathology of the cochlear microcirculation. Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).
- Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice. Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).
- Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research. Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).
- Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention. Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).
- Miller, J., Ren, T. -. Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. Hydrops-induced changes in cochlear blood flow. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).
- Miller, J. M., Ren, T. -. Y., Nuttall, A. L. Studies of inner ear blood flow in animals and human beings. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).
- Nakashima, T., et al. Disorders of cochlear blood flow. Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).
- Nuttall, A. L. Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss. Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).
- Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. Vascular pathophysiology in hearing disorders. Seminars in Hearing. , 242-250 (2012).
- Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).
- Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF). Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).
- Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow. Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).
- Le Floc’h, J., et al. Markers of cochlear inflammation using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).
- Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy. Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).
- Monfared, A., et al. In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy. Otology & Neurotology. 27 (2), 144 (2006).
- Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system. PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).
- Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. The microsphere method for studies of inner ear blood flow. ORL. 50 (6), 355-362 (1988).
- Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).
- Subhash, H. M., et al. Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).
- Reif, R., et al. Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system. PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).
- Nuttall, A. L. Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea. Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).
- Nuttall, A. L. Cochlear blood flow: measurement techniques. American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).
- Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).
- Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of platelets from mouse blood. Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).
- Shi, X., et al. Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow. Hearing Research. 313, 38-46 (2014).
- Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).
- Dai, M., Shi, X. Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow. PloS One. 6 (6), 20652 (2011).
- Shi, X. Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor. American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).
- Hou, Z., et al. Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).
- Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry. American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).
