Mesure du débit sanguin strial dans la cochlée de souris à l’aide d’une fenêtre vasculaire ouverte et d’une microscopie à fluorescence intravitale
Summary
Une approche vaisseau-fenêtre ouverte utilisant des traceurs fluorescents fournit une résolution suffisante pour la mesure du débit sanguin cochléaire (CoBF). La méthode facilite l’étude des changements structurels et fonctionnels du CoBF chez la souris dans des conditions normales et pathologiques.
Abstract
La transduction du son est métaboliquement exigeante, et la fonction normale de la microvascularisation dans la paroi latérale est essentielle pour maintenir le potentiel endocochléaire, le transport des ions et l’équilibre des fluides. Différentes formes de troubles auditifs impliqueraient une microcirculation anormale dans la cochlée. L’étude de la façon dont la pathologie du flux sanguin cochléaire (CoBF) affecte la fonction auditive est difficile en raison du manque de méthodes d’interrogatoire réalisables et de la difficulté d’accès à l’oreille interne. Une fenêtre vasculaire ouverte dans la paroi cochléaire latérale, combinée à la microscopie intravitale à fluorescence, a été utilisée pour étudier les changements de CoBF in vivo, mais surtout chez le cobaye et récemment chez la souris. Cet article et la vidéo associée décrivent la méthode de fenêtre de vaisseau ouvert pour visualiser le flux sanguin dans la cochlée de souris. Les détails comprennent 1) la préparation de la suspension de cellules sanguines marquées par fluorescence provenant de souris; 2) construction d’une fenêtre vasculaire ouverte pour la microscopie intravitale chez une souris anesthésiée, et 3) mesure de la vitesse et du volume du flux sanguin à l’aide d’un enregistrement hors ligne de l’imagerie. La méthode est présentée sous forme vidéo pour montrer comment utiliser l’approche de la fenêtre ouverte chez la souris pour étudier les changements structurels et fonctionnels dans la microcirculation cochléaire dans des conditions normales et pathologiques.
Introduction
La fonction normale de la microcirculation dans la paroi cochléaire latérale (comprenant la majorité des capillaires du ligament spiralé et de la strie vasculaire) est d’une importance cruciale pour le maintien de la fonction auditive1. La CoBF anormale est impliquée dans la physiopathologie de nombreux troubles de l’oreille interne, y compris la perte auditive induite par le bruit, l’hydrops de l’oreille et la presbyacousie 2,3,4,5,6,7,8,9. La visualisation du CoBF intravital permettra de mieux comprendre les liens entre la fonction auditive et la pathologie vasculaire cochléaire.
Bien que la complexité et l’emplacement de la cochlée dans l’os temporal empêchent la visualisation et la mesure directes du CoBF, diverses méthodes ont été développées pour l’évaluation du CoBF, notamment la débitmétrie laser-Doppler (LDF)10,11,12, l’imagerie par résonance magnétique (IRM)13, la microscopie intravitale à fluorescence (FIVM)14, la microendoscopie à fluorescence (FME)15, l’imagerie endoscopique par contraste de moucheture laser (LSCI)16 , et des approches basées sur l’injection de marqueurs marqués et de microsphères marquées radioactivement dans la circulation sanguine (microangiographie optique, OMAG)17,18,19,20. Cependant, aucune de ces méthodes n’a permis un suivi absolu en temps réel des changements dans le CoBF in vivo, à l’exception du FIVM. FIVM, en combinaison avec une fenêtre vasculaire dans la paroi cochléaire latérale, est une approche qui a été utilisée et validée chez le cobaye dans différentes conditions expérimentales par divers laboratoires14,21,22.
Une méthode FIVM a été établie avec succès pour étudier les changements structurels et fonctionnels de la microcirculation cochléaire chez la souris en utilisant l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran comme produit de contraste et un colorant de fluorescence – DiO (perchlorate de 3, 3′-dioctadécyloxacarbocyanine, vert) ou Dil (perchlorate de 1,1-dioctadécyl-3,3,3,3-tétraméthylindocarbocyanine, rouge) – pour prémarquer les cellules sanguines, visualiser les vaisseaux et suivre la vitesse du flux sanguin. Dans la présente étude, le protocole de cette méthode a été décrit pour l’imagerie et la quantification des changements dans le CoBF chez la souris dans des conditions normales et pathologiques (comme après une exposition au bruit). Cette technique donne au chercheur les outils nécessaires pour étudier les mécanismes sous-jacents du CoBF liés au dysfonctionnement auditif et à la pathologie de la strie vasculaire, en particulier lorsqu’il est appliqué en conjonction avec des modèles murins transgéniques facilement disponibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article démontre comment les capillaires dans la paroi latérale cochléaire (et dans la strie vasculaire) d’un modèle murin peuvent être visualisés avec le marquage fluorophore dans une préparation vaisseau-fenêtre ouverte sous un système FIVM. Le modèle murin est largement utilisé et préféré comme modèle de mammifère pour étudier la santé et les maladies humaines. Le protocole décrit ici est une approche réalisable pour l’imagerie et l’étude du CoBF dans la paroi latérale de la souris (en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par NIH/NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH/NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH/NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) et Medical Research Foundation de l’Oregon Health and Science University (OHSU) (X.Shi).
Materials
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
References
- Shi, X. Physiopathology of the cochlear microcirculation. Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).
- Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice. Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).
- Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research. Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).
- Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention. Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).
- Miller, J., Ren, T. -. Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. Hydrops-induced changes in cochlear blood flow. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).
- Miller, J. M., Ren, T. -. Y., Nuttall, A. L. Studies of inner ear blood flow in animals and human beings. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).
- Nakashima, T., et al. Disorders of cochlear blood flow. Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).
- Nuttall, A. L. Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss. Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).
- Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. Vascular pathophysiology in hearing disorders. Seminars in Hearing. , 242-250 (2012).
- Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).
- Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF). Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).
- Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow. Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).
- Le Floc’h, J., et al. Markers of cochlear inflammation using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).
- Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy. Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).
- Monfared, A., et al. In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy. Otology & Neurotology. 27 (2), 144 (2006).
- Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system. PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).
- Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. The microsphere method for studies of inner ear blood flow. ORL. 50 (6), 355-362 (1988).
- Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).
- Subhash, H. M., et al. Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).
- Reif, R., et al. Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system. PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).
- Nuttall, A. L. Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea. Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).
- Nuttall, A. L. Cochlear blood flow: measurement techniques. American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).
- Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).
- Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of platelets from mouse blood. Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).
- Shi, X., et al. Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow. Hearing Research. 313, 38-46 (2014).
- Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).
- Dai, M., Shi, X. Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow. PloS One. 6 (6), 20652 (2011).
- Shi, X. Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor. American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).
- Hou, Z., et al. Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).
- Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry. American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).
