Açık Damar Penceresi ve İntravital Floresan Mikroskobu Kullanılarak Fare Kokleasında Strial Kan Akışının Ölçülmesi
Summary
Floresan izleyiciler kullanan açık damar-pencere yaklaşımı, koklear kan akışı (CoBF) ölçümü için yeterli çözünürlük sağlar. Yöntem, normal ve patolojik koşullar altında farede CoBF’deki yapısal ve fonksiyonel değişikliklerin incelenmesini kolaylaştırır.
Abstract
Sesin iletimi metabolik olarak zordur ve mikrovaskülatürün lateral duvardaki normal fonksiyonu endokoklear potansiyeli, iyon taşınımını ve sıvı dengesini korumak için kritik öneme sahiptir. İşitme bozukluklarının farklı formlarının kokleada anormal mikrosirkülasyon içerdiği bildirilmiştir. Koklear kan akımı (CoBF) patolojisinin işitme fonksiyonunu nasıl etkilediğinin araştırılması, uygulanabilir sorgulama yöntemlerinin eksikliği ve iç kulağa erişimdeki zorluk nedeniyle zordur. Lateral koklear duvardaki açık bir damar penceresi, floresan intravital mikroskopi ile birlikte, CoBF değişikliklerini in vivo olarak incelemek için kullanılmıştır, ancak çoğunlukla kobayda ve sadece son zamanlarda farede. Bu makale ve ilgili video, fare kokleasındaki kan akışını görselleştirmek için açık damar penceresi yöntemini açıklamaktadır. Ayrıntılar arasında 1) farelerden floresan etiketli kan hücresi süspansiyonunun hazırlanması; 2) anestezi uygulanan bir farede intravital mikroskopi için açık bir damar penceresinin oluşturulması ve 3) görüntülemenin çevrimdışı bir kaydını kullanarak kan akış hızının ve hacminin ölçülmesi. Yöntem, normal ve patolojik koşullar altında koklear mikrosirkülasyondaki yapısal ve fonksiyonel değişiklikleri araştırmak için farede açık pencere yaklaşımının nasıl kullanılacağını göstermek için video formatında sunulmuştur.
Introduction
Lateral koklear duvardaki mikrosirkülasyonun normal fonksiyonu (spiral ligament ve stria vascularis’teki kılcal damarların çoğunluğunu içerir) işitme fonksiyonunun korunması için kritik öneme sahiptir1. Anormal CoBF, gürültüye bağlı işitme kaybı, kulak hidrops ve presbycusis 2,3,4,5,6,7,8,9 dahil olmak üzere birçok iç kulak bozukluğunun patofizyolojisinde rol oynar. İntravital CoBF’nin görselleştirilmesi, işitme fonksiyonu ile koklear vasküler patoloji arasındaki bağlantıların daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.
Kokleanın temporal kemik içindeki karmaşıklığı ve yeri, CoBF’nin doğrudan görüntülenmesini ve ölçülmesini engellese de, CoBF’nin değerlendirilmesi için lazer-doppler flowmetri (LDF)10,11,12, manyetik rezonans görüntüleme (MRG)13, floresan intravital mikroskopi (FIVM)14, floresan mikroendoskopi (FME)15, endoskopik lazer benek kontrast görüntüleme (LSCI)16 gibi çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. ve etiketli belirteçlerin ve radyoaktif olarak etiketlenmiş mikrosferlerin kan dolaşımına enjeksiyonuna dayanan yaklaşımlar (optik mikroanjiyografi, OMAG)17,18,19,20. Bununla birlikte, bu yöntemlerden hiçbiri, FIVM hariç, CoBF’deki değişikliklerin in vivo olarak mutlak gerçek zamanlı izlenmesini sağlamamıştır. FIVM, lateral koklear duvardaki bir damar penceresi ile birlikte, çeşitli laboratuvarlar tarafından farklı deney koşulları altında kobaylarda kullanılan ve doğrulanan bir yaklaşımdır 14,21,22.
Kontrast madde olarak floresein izotiyosiyanat (FITC)-dekstran ve bir floresan boya (3, 3′-dioktadesiloksakarbosiyanin perklorat, yeşil) veya Dil (1,1-dioktadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate, red) kullanılarak faredeki koklear mikrosirkülasyondaki yapısal ve fonksiyonel değişiklikleri incelemek için bir FIVM yöntemi başarıyla oluşturulmuştur. Bu çalışmada, normal ve patolojik koşullar altında (gürültüye maruz kaldıktan sonra olduğu gibi) farede CoBF’deki değişiklikleri görüntülemek ve ölçmek için bu yöntemin protokolü tanımlanmıştır. Bu teknik, araştırmacıya, özellikle hazır transgenik fare modelleriyle birlikte uygulandığında, stria vascularis’teki işitme disfonksiyonu ve patoloji ile ilgili CoBF’nin altta yatan mekanizmalarını araştırmak için gereken araçları sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, bir fare modelinin koklear lateral duvarındaki (ve stria vascularis’teki) kılcal damarların, bir FIVM sistemi altında açık bir kap penceresi hazırlığında florofor etiketleme ile nasıl görselleştirilebileceği gösterilmektedir. Fare modeli, insan sağlığı ve hastalıklarının araştırılmasında memeli modeli olarak yaygın olarak kullanılmakta ve tercih edilmektedir. Burada açıklanan protokol, FIVM sistemi altında açık bir damar penceresi kullanarak fare lateral duvarında (özellikle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) ve Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi’nden (OHSU) Tıbbi Araştırma Vakfı (X.Shi) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
References
- Shi, X. Physiopathology of the cochlear microcirculation. Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).
- Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice. Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).
- Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research. Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).
- Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention. Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).
- Miller, J., Ren, T. -. Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. Hydrops-induced changes in cochlear blood flow. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).
- Miller, J. M., Ren, T. -. Y., Nuttall, A. L. Studies of inner ear blood flow in animals and human beings. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).
- Nakashima, T., et al. Disorders of cochlear blood flow. Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).
- Nuttall, A. L. Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss. Noise and Health. 2 (5), 17 (1999).
- Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. Vascular pathophysiology in hearing disorders. Seminars in Hearing. , 242-250 (2012).
- Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).
- Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF). Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).
- Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow. Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).
- Le Floc’h, J., et al. Markers of cochlear inflammation using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).
- Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy. Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).
- Monfared, A., et al. In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy. Otology & Neurotology. 27 (2), 144 (2006).
- Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system. PLoS One. 13 (2), 0191978 (2018).
- Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. The microsphere method for studies of inner ear blood flow. ORL. 50 (6), 355-362 (1988).
- Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).
- Subhash, H. M., et al. Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).
- Reif, R., et al. Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system. PLoS One. 7 (12), 52041 (2012).
- Nuttall, A. L. Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea. Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).
- Nuttall, A. L. Cochlear blood flow: measurement techniques. American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).
- Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).
- Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of platelets from mouse blood. Journal of Visualized Experiments. (147), e59803 (2019).
- Shi, X., et al. Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow. Hearing Research. 313, 38-46 (2014).
- Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).
- Dai, M., Shi, X. Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow. PloS One. 6 (6), 20652 (2011).
- Shi, X. Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor. American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).
- Hou, Z., et al. Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).
- Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry. American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).
