تحليل التهديف المنهجي لالتهاب الأمعاء في نموذج التهاب القولون الناجم عن كبريتات الصوديوم مورين ديكتران
Summary
التهديف المنهجي لالتهاب الأمعاء باستخدام نظام مجاني بمساعدة الكمبيوتر هو أداة قوية لمقارنة التغيرات الهسطولوجية كميا في نماذج التهاب القولون التي تتميز بوجود القرحة والتغيرات الالتهابية. يعزز تقييم نقاط التهاب القولون النسيجي الملاحظات السريرية ويسهل تفسير البيانات.
Abstract
نماذج التهاب القولون مورين هي الأدوات التي تستخدم على نطاق واسع في الدراسات التي تركز على فهم علم الأحياء المرضية للاضطرابات المعوية الالتهابية. ومع ذلك، لا يزال يتعين تحديد معايير قوية للقياس الكمي الموضوعي والتكراري لشدة المرض. تعتمد معظم طرق تحليل التهاب القولون على تسجيل الهسهولوجيا المحدود لقطاعات صغيرة من الأمعاء ، مما يؤدي إلى تحليلات جزئية أو متحيزة. هنا، ونحن الجمع بين الحصول على صورة عالية الدقة والتحليل الطولي للقولون بأكمله لتحديد إصابة الأمعاء والتقرح في كبريتات الصوديوم dextran (DSS) النموذج المستحث من التهاب القولون مورين. يسمح هذا البروتوكول بتوليج نتائج موضوعية وقابلة للاستنساخ دون تدريب مكثف للمستخدم. هنا، نقدم تفاصيل شاملة عن إعداد العينات وتحليل الصور باستخدام أمثلة من البيانات من التهاب القولون المستحث DSS. يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة مع النماذج الأخرى لالتهاب القولون المورين التي لديها التهاب كبير مرتبط بإصابة المخاطية. نحن نثبت أن جزء من الغشاء المخاطي الملتهب / المصاب والمتآكل / المتقرح نسبة إلى الطول الكامل للقولون يوازي بشكل وثيق النتائج السريرية مثل فقدان الوزن وسط تطور المرض الناجم عن DSS. يوفر هذا البروتوكول النسيجي وقتا موثوقا ومساعدة فعالة من حيث التكلفة لتوحيد تحليلات نشاط المرض بطريقة غير متحيزة في تجارب التهاب القولون DSS.
Introduction
الحاجز الظهاري المعدي المعوي يلعب دورا محوريا في فصل المستضدات الإنارة ومسببات الأمراض من مقصورات الأنسجة الكامنة1. ترتبط الإصابات الظهارية والجروح المخاطية التي تظهر في الحالات المرضية مثل مرض التهاب الأمعاء (IBD) أو نقص التروية أو الإصابة الجراحية بالأعراض السريرية التي تشمل الإسهال وفقدان الوزن والدم في البراز وآلام البطن. استجابة للإصابة، تهاجر الخلايا الظهارية وتتكاثر لإعادة ظهارة وإصلاح عيوب الحاجز المخاطي. حل الالتهاب ورد سلامة المخاطية حاسمة لإعادة تأسيس التوازن المخاطي المعوي ووظيفة2،3،4.
وقد استخدمت نماذج حيوانية مختلفة لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة التي ترتبط مع الأضرار التي لحقت الحاجز الظهاري المعوي. تستخدم على نطاق واسع نماذج راسخة وسهلة التطبيق من التهاب القولون المستحث كيميائيا ، لا سيما في الدراسات المتعلقة بالإصابة الالتهابية مثل IBD. نموذج التهاب القولون مورين المشتركة، القابلة للاستنساخ، وموثوق بها توظف كبريتات الصوديوم dextran (DSS) بوساطة إصابة القولون والالتهاب. تختلف شدة المرض اعتمادا على سلالة الماوس وجرعة DSS وطول إدارة DSS والوزن الجزيئي ل DSS5و6و7.
عادة ما يتم تقييم تلف المخاط المعوي أثناء التهاب القولون DSS باستخدام مؤشر نشاط المرض (DAI) ، وهي درجة مركبة يحددها فقدان الوزن ، ومحتوى دم البراز ، واتساق البراز. محتوى الدم البراز يمكن أن تكون مجهرية (الكشف عن استخدام اختبار حمض غواياك البراز) أو العياني; يصنف الاتساق البرازي على أنه صلب أو ناعم أو سائل (أي الإسهال)5،8. يمكن أن يكون تسجيل هذه المعلمات السريرية ذاتيا وقد يختلف اعتمادا على تجربة المستخدم وتحيزه ، على الرغم من أن البيانات توفر بشكل عام معلومات موثوقة وبالتالي يستخدمها باحثو IBD على نطاق واسع. وعلى النقيض من ذلك، لا توجد طريقة مقبولة عموما للتقييم النسيجي للضرر المخاطي. الأكثر شيوعا، يتم فحص مناطق مختارة من القولون من قبل أخصائي أمراض مدرب وسجل على أساس العديد من المعلمات التي عادة ما تشمل إصابة سرداب وتسلل الكريات البيض9،10،11. ومع ذلك، لأن عدد المعلمات التي تم التحقيق فيها وكمية الأنسجة التي تم تحليلها يختلف بشكل كبير بين التقارير الفردية، فإن قابلية مقارنة العديد من الدراسات المنشورة محدودة. للحد من التحيز المراقب وتعزيز التوافق بين الدراسات، وبروتوكول التهديف النسيجي المثالي ينبغي: 1) تشمل طول القولون بأكمله، والتهاب المخاطية المعوية في معظم الأحيان متغير وتخطي الآفات شائعة، 2) الحد من التحليل إلى مفتاح محدد والمعلمات قابلة للتفسير بسهولة للحد من الذاتية، 3) تسهيل المعالجة السريعة والمتسقة لأعداد كبيرة من العينات، و 4) استخدام أدوات متاحة على نطاق واسع وبأسعار معقولة للحصول على البيانات والتحليل والعرض.
هنا نحن نصف تقنية لمعالجة القولون بأكمله أو أجزاء طويلة من الأمعاء الدقيقة في تكوين “لفة السويسرية” جنبا إلى جنب مع استخدام نظام تسجيل مجاني بمساعدة الكمبيوتر لتحليل التهاب المخاطية المعوية والضرر بسبب التهاب القولون الناجم عن DSS.
Protocol
Representative Results
Discussion
لدينا نظام نقاط التهاب القولون النسيجي يشكل أداة موثوق بها لقياس التهاب الأنسجة والضرر في الأمعاء. يوفر هذا النهج فهما أفضل لحالة الأمراض النسيجية للجهاز بأكمله دون تحيز لاختيار مناطق صغيرة أو أقسام غير مكتملة. ومن بين الخطوات الحاسمة لتنفيذ هذا البروتوكول بنجاح الإعداد السليم للقوائم ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يرغب المؤلفون في الاعتراف بالدعم المقدم من تمويل المعاهد القومية للصحة DK055679 و DK089763 و DK079392 و DK061739 و DK072564 وخدمات مسح الشرائح المرضية بجامعة ميشيغان.
Materials
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
- Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
- Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617 (2012).
- Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
- Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
- Luna, L. G. . Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , (1968).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).
