Murine Dextran Sodyum Sülfat Kaynaklı Kolit Modelinde Bağırsak İltihabı İçin Sistematik Puanlama Analizi
Summary
Ücretsiz bilgisayar destekli bir sistem kullanılarak bağırsak iltihabının sistematik olarak puanlanması, ülser ve enflamatuar değişikliklerin varlığı ile karakterize kolit modellerindeki histopatolojik değişiklikleri nicel olarak karşılaştırmak için güçlü bir araçtır. Histolojik kolit skoru değerlendirmesi klinik gözlemleri güçlendirir ve veri yorumlamayı kolaylaştırır.
Abstract
Murine kolit modelleri, enflamatuar bağırsak bozukluklarının patobiyolojisini anlamaya odaklanan çalışmalarda yoğun olarak kullanılan araçlardır. Bununla birlikte, hastalık şiddetinin objektif ve tekrarlanabilir nicelemesi için sağlam standartlar tanımlanmaya devam etmektedir. Kolit analiz yöntemlerinin çoğu, küçük bağırsak segmentlerinin sınırlı histolojik puanlamasına dayanır ve kısmi veya taraflı analizlere yol açar. Burada, dektran sodyum sülfat (DSS) kaynaklı murine kolit modelinde bağırsak yaralanması ve ülserasyonunu ölçmek için tüm kolonun yüksek çözünürlüklü görüntü alımını ve boyuna analizini birleştiriyoruz. Bu protokol, kapsamlı kullanıcı eğitimi olmadan objektif ve tekrarlanabilir sonuçların üretilmesine izin verir. Burada, DSS kaynaklı kolitten elde edilen verilerin örneklerini kullanarak numune hazırlama ve görüntü analizi hakkında kapsamlı ayrıntılar sunuyoruz. Bu yöntem, mukozal yaralanma ile ilişkili önemli inflamasyona sahip diğer murine kolit modellerine kolayca uyarlanabilir. Kolonun tam uzunluğuna göre iltihaplı/yaralı ve aşınmış/ülserli mukoza fraksiyonunun DSS kaynaklı hastalık ilerlemesi sırasında kilo kaybı gibi klinik bulgularla yakından paralellik gösterdiğini gösteriyoruz. Bu histolojik protokol, DSS kolit deneylerinde hastalık aktivitesinin analizlerini tarafsız bir şekilde standartlaştırmak için güvenilir bir zaman ve uygun maliyetli yardım sağlar.
Introduction
Gastrointestinal epitel bariyeri, luminal antijenlerin ve patojenlerin alttaki doku bölmelerinden ayrılmasında önemli bir rol oynar1. İnflamatuvar bağırsak hastalığı (IBD), iskemi veya cerrahi yaralanma gibi patolojik durumlarda görülen epitel yaralanması ve mukozal yaralar ishal, kilo kaybı, dışkıda kan ve karın ağrısı gibi klinik semptomlarla ilişkilidir. Yaralanmaya yanıt olarak, epitel hücreleri mukozal bariyer kusurlarını yeniden epitelleştirmek ve onarmak için göç eder ve çoğalır. enflamasyonun çözülmesi ve mukozal bütünlüğün iadesi, bağırsak mukozal homeostazının ve fonksiyon 2 ,3,4‘ün yeniden kurulması için çok önemlidir.
Bağırsak epitel bariyerinin hasarı ile ilişkili alttaki moleküler mekanizmaları incelemek için çeşitli hayvan modelleri gütlenmiştir. Kimyasal olarak indüklenen kolitin iyi kurulmuş ve kolayca uygulanabilir modelleri, özellikle IBD gibi enflamatuar yaralanma ile ilgili çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Yaygın, tekrarlanabilir ve güvenilir bir murine kolit modeli, dektran sodyum sülfat (DSS) aracılı kolon yaralanması ve iltihabını kullanmaktadır. Hastalığın şiddeti fare suşuna, DSS dozu, DSS uygulama uzunluğu ve DSS5, 6,7moleküler ağırlığına bağlı olarak değişir.
DSS kolit sırasında bağırsak mukozal hasarı genellikle kilo kaybı, dışkı kan içeriği ve dışkı kıvamına göre belirlenen bileşik bir puan olan Hastalık Aktivite Endeksi (DAI) kullanılarak değerlendirilir. Dışkı kan içeriği mikroskobik (dışkı guaiac asit testi kullanılarak tespit edilebilir) veya makroskopik olabilir; dışkı kıvamı sert, yumuşak veya sıvı (yani ishal) olarak sınıflandırılır5,8. Bu klinik parametrelerin puanlaması öznel olabilir ve kullanıcının deneyimine ve önyargısına bağlı olarak değişebilir, ancak genel olarak veriler güvenilir bilgi sağlar ve bu nedenle IBD araştırmacıları tarafından yaygın olarak kullanılır. Buna karşılık, mukozal hasarın histolojik olarak değerlendirilmesi için genel olarak kabul edilen bir yöntem yoktur. En yaygın olarak, kolonun seçilen alanları eğitimli bir patolog tarafından incelenir ve genellikle kript yaralanması ve lökosit infiltrasyonunu9, 10,11içeren çeşitli parametrelere göre puanlanır. Bununla birlikte, araştırılan parametrelerin sayısı ve analiz edilen doku miktarı bireysel raporlar arasında önemli ölçüde değiştiğinden, yayınlanan birçok çalışmanın karşılaştırılabilme kabiliyeti sınırlıdır. Gözlemci önyargısını azaltmak ve çalışmalar arası uyumluluğu artırmak için ideal bir histolojik puanlama protokolü: 1) bağırsak mukoza iltihabı en sık değişken olduğu ve atlama lezyonları yaygın olduğu için kolonun tüm uzunluğunu içermelidir, 2) öznellik azaltmak için analizi belirli anahtar ve kolayca yorumlanabilir parametrelerle sınırlayın, 3) çok sayıda örneğin hızlı, tutarlı bir şekilde işlenmesini kolaylaştırmak ve 4) veri toplama, analiz ve sunum için yaygın ve uygun fiyatlı araçlar kullanmak.
Burada, ince bağırsağın tüm kolon veya uzun segmentlerini bir “İsviçre rulosu” konfigürasyonunda işlemek için bir teknik ve DSS kaynaklı kolit nedeniyle bağırsak mukozal iltihabını ve hasarını analiz etmek için ücretsiz bir bilgisayar destekli puanlama sisteminin kullanımını açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Histolojik Kolit Skor sistemimiz doku iltihabını ve bağırsaktaki hasarı ölçmek için güvenilir bir araçtır. Bu yaklaşım, küçük alanlar veya eksik bölümler seçme önyargısı olmadan tüm organın histopatolojik durumunun daha iyi anlaşılmasını sağlar. Bu protokolü başarıyla yürütmek için kritik adımlar arasında, kolon uzunluğunun en az% 90’ının analizine izin veren İsviçre rulolarının uygun şekilde hazırlanması vardır; epitel mahzenlerinin boyuna görünümlerine sahip düz ve d?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar NIH’nin DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 ve Michigan Üniversitesi Patoloji Slayt Tarama Hizmetleri’nden destek almak istemeleridir.
Materials
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
- Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
- Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617 (2012).
- Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
- Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
- Luna, L. G. . Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , (1968).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).
