Análisis sistemático de puntuación para la inflamación intestinal en un modelo de colitis inducida por sulfato de sodio de dextrano de murina
Summary
La puntuación sistemática de la inflamación intestinal utilizando un sistema asistido por computadora libre es una poderosa herramienta para comparar cuantitativamente los cambios histopatológicos en los modelos de colitis caracterizados por la presencia de úlceras y cambios inflamatorios. La evaluación de la puntuación de colitis histológica fortalece las observaciones clínicas y facilita la interpretación de los datos.
Abstract
Los modelos de colitis murina son herramientas que se emplean ampliamente en estudios centrados en la comprensión de la patobiología de los trastornos inflamatorios intestinales. Sin embargo, quedan por definir normas sólidas para la cuantificación objetiva y reproducible de la gravedad de la enfermedad. La mayoría de los métodos de análisis de colitis se basan en una puntuación histológica limitada de pequeños segmentos del intestino, lo que conduce a análisis parciales o sesgados. Aquí, combinamos la adquisición de imágenes de alta resolución y el análisis longitudinal de todo el colon para cuantificar la lesión intestinal y la ulceración en el modelo inducido de sulfato sódico dextrano (DSS) de colitis murina. Este protocolo permite la generación de resultados objetivos y reproducibles sin una amplia formación del usuario. Aquí, proporcionamos detalles completos sobre la preparación de muestras y el análisis de imágenes utilizando ejemplos de datos de colitis inducida por DSS. Este método se puede adaptar fácilmente a otros modelos de colitis murina que tienen inflamación significativa asociada con lesiones mucosa. Demostramos que la fracción de mucosa inflamada/lesionada y erosionada/ulcerada en relación con la longitud completa del colon es paralela a los hallazgos clínicos como la pérdida de peso en medio de la progresión de la enfermedad inducida por el SSD. Este protocolo histológico proporciona un tiempo fiable y una ayuda rentable para estandarizar los análisis de la actividad de la enfermedad de una manera imparcial en los experimentos de colitis del SDS.
Introduction
La barrera epitelial gastrointestinal desempeña un papel fundamental en la separación de antígenos luminales y patógenos de los compartimentos de tejido subyacentes1. Las lesiones epiteliales y las heridas mucosas observadas en condiciones patológicas como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), la isquemia o lesiones quirúrgicas están asociadas con síntomas clínicos que incluyen diarrea, pérdida de peso, sangre en las heces y dolor abdominal. En respuesta a lesiones, las células epiteliales migran y proliferan para volver a epitelializar y reparar defectos de barrera mucosa. La resolución de la inflamación y restitución de la integridad mucosa son cruciales para restablecer la homeostasis mucosa intestinal y la función2,3,4.
Se han empleado varios modelos animales para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes que están asociados con el daño a la barrera epitelial intestinal. Modelos bien establecidos y fácilmente aplicables de colitis inducida químicamente son ampliamente utilizados, particularmente en estudios relacionados con lesiones inflamatorias como la EII. Un modelo de colitis de murina común, reproducible y confiable emplea sulfato de sodio dextrano (DSS) mediación de lesiones en colones e inflamación. La gravedad de la enfermedad varía dependiendo de la cepa del ratón, dosis de DSS, duración de la administración del SSD y peso molecular del DSS5,6,7.
El daño de la mucosa intestinal durante la colitis del SDS generalmente se evalúa utilizando el Índice de Actividad de la Enfermedad (DAI, por suspens), una puntuación compuesta determinada por la pérdida de peso, el contenido de sangre fecal y la consistencia de las heces. El contenido sanguíneo fecal puede ser microscópico (detectado usando una prueba de ácido guaiac de heces) o macroscópico; consistencia fecal se clasifica como dura, suave o líquida (es decir, diarrea)5,8. La puntuación de estos parámetros clínicos puede ser subjetiva y puede variar dependiendo de la experiencia y el sesgo del usuario, aunque en general, los datos proporcionan información fiable y por lo tanto es ampliamente utilizado por los investigadores del EII. Por el contrario, no existe un método generalmente aceptado para la evaluación histológica del daño mucoso. Más comúnmente, las áreas seleccionadas del colon son inspeccionadas por un patólogo entrenado y puntuadas en base a varios parámetros que generalmente incluyen lesión de cripta e infiltración de leucocitos9,10,11. Sin embargo, debido a que el número de parámetros investigados y la cantidad de tejido analizado varía considerablemente entre los informes individuales, la comparabilidad de muchos estudios publicados es limitada. Para reducir el sesgo de los observadores y mejorar la concordancia entre estudios, un protocolo de puntuación histológica ideal debe: 1) incluir toda la longitud del colon, ya que la inflamación de la mucosa intestinal es más a menudo variable y las lesiones de salto son comunes, 2) limitar el análisis a parámetros clave específicos y fácilmente interpretables para reducir la subjetividad, 3) facilitar el procesamiento rápido y consistente de un gran número de muestras, y 4) utilizar herramientas ampliamente disponibles y asequibles para la adquisición, análisis y presentación de datos.
Aquí describimos una técnica para procesar segmentos enteros de colon o largos del intestino delgado en una configuración de “rollo suizo” junto con el uso de un sistema gratuito de puntuación asistida por computadora para analizar la inflamación y el daño de la mucosa intestinal debido a la colitis inducida por el DSS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro sistema de puntuación de colitis histológica constituye una herramienta confiable para cuantificar la inflamación del tejido y el daño en el intestino. Este enfoque proporciona una mejor comprensión del estado histopatológico de todo el órgano sin el sesgo de seleccionar áreas pequeñas o secciones incompletas. Entre los pasos críticos para ejecutar con éxito este protocolo se encuentran la preparación adecuada de rollos suizos que permiten el análisis de al menos el 90% de la longitud del colon; orie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer el apoyo de la financiación de los NIH DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 y los Servicios de Escaneo de Diapositivas patológicas de la Universidad de Michigan.
Materials
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
- Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
- Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617 (2012).
- Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
- Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
- Luna, L. G. . Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , (1968).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).
