뮤린 Dextran 나트륨 황산염 유도 대장염 모형에 있는 장 염증을 위한 체계적인 채점 분석
Summary
무료 컴퓨터 보조 시스템을 사용하여 장 염증의 체계적인 점수는 궤양과 염증 변화의 존재를 특징으로 하는 대장염 모델의 조직 병리학적 변화를 정량적으로 비교할 수 있는 강력한 도구입니다. 조직학 대장염 점수 평가는 임상 관찰을 강화하고 데이터 해석을 용이하게합니다.
Abstract
뮤린 대장염 모델은 염증성 장 질환의 병리학을 이해하는 데 초점을 맞춘 연구에서 광범위하게 사용되는 도구입니다. 그러나 질병 심각도의 객관적이고 재현 가능한 정량화를 위한 강력한 표준은 정의되어야 합니다. 대부분의 대장염 분석 방법은 소장의 작은 세그먼트의 제한된 조직학 점수에 의존하여 부분적 또는 편향된 분석으로 이어집니다. 여기서, 우리는 전체 결장의 고해상도 영상 수집 및 세로 분석을 결합하여 뮤린 대장염의 유도된 탈파나트륨(DSS)에서 장 내 부상 및 궤양을 정량화한다. 이 프로토콜은 광범위한 사용자 교육 없이 객관적이고 재현 가능한 결과를 생성할 수 있도록 합니다. 여기서는 DSS 유도 대장염의 데이터 예를 사용하여 샘플 준비 및 이미지 분석에 대한 포괄적인 세부 정보를 제공합니다. 이 방법은 점막 손상과 관련된 중요한 염증이있는 뮤린 대장염의 다른 모델에 쉽게 적응 할 수 있습니다. 우리는 결장의 전체 길이에 비해 염증 / 부상 및 침식 / 궤양 점막의 분획이 DSS 유발 질병 진행 중 체중 감소와 같은 임상 연구 결과를 유사하게 한다는 것을 보여줍니다. 이 조직학적 프로토콜은 DSS 대장염 실험에서 편견없는 방식으로 질병 활동의 분석을 표준화하는 신뢰할 수있는 시간과 비용 효율적인 원조를 제공합니다.
Introduction
위장관 상피 장벽은 기본 조직 구획1에서발광 항원 및 병원균을 분리하는 데 중추적 인 역할을한다. 염증성 장 질환 (IBD), 허혈 또는 외과 적 부상과 같은 병리학 적 조건에서 볼 수있는 상피 손상 및 점막 상처는 설사, 체중 감소, 대변의 혈액 및 복통을 포함하는 임상 증상과 관련이 있습니다. 상해에 응하여, 상피 세포는 점막 결점을 다시 상형화하고 복구하기 위하여 이주하고 증식합니다. 점막 무결성의 염증 및 배상금의 해결은 장 점막 항상성 및 기능2,3,4를재확립하는 데 매우 중요합니다.
다양한 동물 모델은 장 상피 장벽의 손상과 관련된 기본 분자 메커니즘을 연구하기 위해 사용되었습니다. 화학적으로 유도된 대장염의 잘 확립되고 쉽게 적용 가능한 모델은 특히 IBD와 같은 염증성 손상과 관련된 연구에서 널리 사용됩니다. 일반적인 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 뮤린 대장염 모델은 요염 나트륨(DSS)을 매개한 대장 상해와 염증을 사용합니다. 질병의 중증도는 마우스 변형, DSS 투여 량, DSS 투여 길이 및 DSS5,6,7의분자량에 따라 다릅니다.
DSS 대장염 중 장 점막 손상은 일반적으로 체중 감소, 대변 혈중 및 대변 일관성에 의해 결정되는 복합 점수인 질병 활동 지수(DAI)를 사용하여 평가됩니다. 대변 혈액 함량은 현미경 (대변 과이악 산 검사를 사용하여 검출) 또는 거시화 될 수 있습니다; 대변 일관성은 하드, 소프트 또는 액체 (즉, 설사) 5,8로분류된다. 이러한 임상 매개 변수의 점수는 주관적이고 사용자의 경험과 편견에 따라 달라질 수 있지만 전반적으로 데이터는 신뢰할 수있는 정보를 제공하고 IBD 연구원이 널리 사용됩니다. 대조적으로, 점막 손상의 조직학적 평가를 위한 일반적으로 허용되는 방법은 없습니다. 가장 일반적으로, 결장의 선택된 지역은 훈련된 병리학자에 의해 검사되고 일반적으로 토굴 손상 및 백혈구 침투9,10,11을포함하는 몇몇 매개변수를 기준으로 득점됩니다. 그러나, 조사된 파라미터의 수와 분석된 조직의 양은 개별 보고 사이에서 상당히 다르기 때문에, 많은 간행된 연구 결과의 비교는 제한됩니다. 관찰자 편향을 줄이고 연구 간 일치를 향상시키기 위해 이상적인 조직적 채점 프로토콜은 1) 대장의 전체 길이를 포함해야 한다: 장 점막 염증이 가장 자주 가변적이고 병변이 일반적이기 때문에, 2) 특정 키에 대한 분석을 제한하고 쉽게 해석 할 수있는 매개 변수로 주관성을 감소시키고, 3) 많은 수의 샘플 및 4) 널리 사용할 수있는 데이터 및 4) 사용 가능한 데이터 제공에 사용할 수 있습니다.
여기서우리는 DSS 유도 대장염으로 인해 장 점막 염증및 손상을 분석하기 위해 무료 컴퓨터 보조 점수 시스템의 사용과 함께 “스위스 롤”구성으로 소장의 전체 결장 또는 긴 세그먼트를 처리하는 기술을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리의 조직학 대장염 점수 시스템은 내장의 조직 염증과 손상을 정량화하는 신뢰할 수있는 도구를 구성합니다. 이 접근법은 작은 지역 또는 불완전한 단면도의 선택의 편견 없이 전체 기관의 조직 병리학 상태의 향상된 이해를 제공합니다. 이 프로토콜을 성공적으로 실행하는 중요한 단계 중에는 결장 길이의 90% 이상을 분석할 수 있는 스위스 롤을 적절히 준비하는 단계입니다. 파라핀 포함 및 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 NIH 자금 DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 및 미시간 대학 병리학 슬라이드 스캐닝 서비스의 지원을 인정하고자합니다.
Materials
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
- Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
- Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617 (2012).
- Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
- Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
- Luna, L. G. . Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , (1968).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).
