تلطيخ immunofluorescent لتصور البروتينات المرتبطة Heterochromatin في الغدد اللعابية Drosophila
Summary
يهدف هذا البروتوكول إلى تصور مجاميع الهتيروماتين في خلايا البوليتين Drosophila.
Abstract
يمكن أن يكون تصور مجاميع الهتيروماتين عن طريق التصبغ المناعي أمرا صعبا. يتم الحفاظ على العديد من مكونات الثدييات من الكروماتين في Drosophila melanogaster. لذلك، وهو نموذج ممتاز لدراسة تشكيل heterochromatin والصيانة. الخلايا المتعددة، مثل تلك الموجودة في الغدد اللعابية من يرقات نجمة النستار الثالثة D. melanogaster، توفر أداة ممتازة لمراقبة الكروماتين تضخيم ما يقرب من ألف مرة، وسمحت للباحثين لدراسة التغيرات في توزيع التركروماتين في النواة. على الرغم من أن مراقبة مكونات هيتيركروماتين يمكن أن تتم مباشرة في مستحضرات كروموسوم البوليتين ، يمكن تغيير توطين بعض البروتينات من خلال شدة العلاج. لذلك ، فإن التصور المباشر للتركروماتين في الخلايا يكمل هذا النوع من الدراسة. في هذا البروتوكول، نقوم بوصف تقنيات التصبغ المناعي المستخدمة لهذا النسيج، واستخدام الأجسام المضادة الفلورية الثانوية، والمجهر البؤري لمراقبة هذه المجاميع الهتيروماتين بمزيد من الدقة والتفاصيل.
Introduction
منذ الدراسات المبكرة لإميل هيتز1، يعتبر هيتيركروماتين منظما مهما للعمليات الخلوية مثل التعبير الجيني ، والفصل الميوتي والميتوتيك للكروموسومات ، والحفاظ على استقرار الجينوم2و3و4.
وينقسم الهتيروماتين أساسا إلى نوعين: هيتيركروماتين التأسيسية التي تحدد بشكل مميز تسلسل المتكررة، والعناصر القابلة للانتقال التي توجد في مواقع كروموسوم محددة مثل التيلوميرات والقنطورات. هذا النوع من heterochromatin هو تعريف أساسا اللاجينية من قبل علامات الهستون محددة مثل دي أو ثلاثي ميثيل ليسين 9 من الهستون H3 (H3K9me3) وربط بروتين هيتيروكروماتين 1a (HP1a)5,6. من ناحية أخرى، لغات heterochromatin الكلية من خلال ذراعي الكروموسوم ويتكون أساسا من الجينات صامتة تنمويا7،8. وقد كشف عن التئاس المناعة من كتل heterochromatin في خلايا ميتافيزي، أو مراقبة المجاميع heterochromatin في الخلايا بين المراحل، الكثير من الضوء في فهم تشكيل ووظيفة المناطق غير لوني9.
وقد سمح استخدام Drosophila كنظام نموذجي لتطوير الأدوات الأساسية لدراسة الهتيروماتين دون استخدام المجهر الإلكتروني10. منذ وصف تأثير الموقف المتنوع واكتشاف البروتينات المرتبطة بالهيتوكروماتين ، مثل HP1a ، وتعديلات ما بعد الهستون بعد الترجمية ، طورت العديد من المجموعات العديد من التقنيات الكيميائية المناعية التي تسمح بتصور هذه المناطق غير اللونية10،11.
وتستند هذه التقنيات على استخدام أجسام مضادة محددة تتعرف على البروتينات المرتبطة بالهتيروماتين أو علامات الهستون. لكل نوع الخلية والأجسام المضادة، يجب تحديد شروط التثبيت والتهيئة تجريبيا. أيضا، قد تختلف الظروف إذا تم استخدام عمليات ميكانيكية إضافية مثل تقنيات السحق. في هذا البروتوكول، ونحن نصف استخدام الغدد اللعابية Drosophila لدراسة بؤر غير لونية. الغدد اللعابية لديها خلايا متعددة الأضلاع تحتوي على أكثر من 1000 نسخة من الجينوم ، مما يوفر رؤية مكبرة لمعظم ميزات الكروماتين ، باستثناء الحمض النووي للأقمار الصناعية وبعض المناطق غير اللونية التي تخضع للتكفير. ومع ذلك ، يتم تصور مناطق heterochromatin بسهولة في مستحضرات كروموسوم البوليتين ، ولكن تقنيات السحق قد تعطل في بعض الأحيان المجمعات المميزة المرتبطة بالكروماتين أو بنية الكروماتين. لذلك ، يمكن أن يتجاوز تحديد موقع المناعة للبروتينات في أنسجة الغدة اللعابية الكاملة هذه الآثار غير المرغوب فيها. لقد استخدمنا هذا البروتوكول للكشف عن العديد من البروتينات المقيدة بالكروماتين ، وأثبتنا أن هذا البروتوكول جنبا إلى جنب مع مخزونات Drosophila المتحولة يمكن استخدامه لدراسة اضطراب الهتيروماتين12.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن للوظيفة الخلوية للكائنات الحية النواة تحديد الهيكل ثلاثي الأبعاد داخل النواة ، والذي تدعمه التفاعلات بين البروتينات المختلفة مع الكروماتين والجزيئات المختلفة بما في ذلك الحمض النووي الريبي. في السنوات الثلاث الماضية، والمكثفات البيولوجية التي لها أهمية، بما في ذلك هيتيركروماتين،…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ماركو أنطونيو روزاليس فيغا وهابيل سيغورا على التقاط بعض الصور الكونفوكوكال، وكارمن مونيوز لإعداد وسائل الإعلام، والدكتور أرتورو بيمنتل، .C أندريس ساراليغوي، والدكتور كريس وود من LMNA للحصول على المشورة بشأن استخدام المجاهر.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen MCT-150-C | 11351904 | brand not critical |
| 16% formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| AF1 Citifluor | Ted pella | 19470 | 25 mL |
| BSA, Molecular Biology Grade | Roche | 10735078001 | brand not critical |
| Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors |
Merck | 5892953001 | |
| Coverslip | Corning | CLS285022-200EA | 22×22, brand not critical |
| DTT | Sigma | d9779 | brand not critical |
| EDTA | Sigma | E5134 | brand not critical |
| EGTA | brand not critical | ||
| Glass slide | Gold seal | 3011 | brand not critical |
| H3BO3 | Baker | 0084-01 | brand not critical |
| H3K9me3 | Abcam | 8889 | |
| HP1a | Hybridoma Bank | C1A9 | Product Form Concentrate 0.1 mL |
| KCl | Baker | 3040-01 | brand not critical |
| Methanol | Baker | 9070-03 | brand not critical |
| NaCl | Sigma | 71376 | brand not critical |
| NaOH | brand not critical | ||
| PIPES | brand not critical | ||
| Rotator | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Labquake Tube Shaker |
| Thermo Mixer C | Eppendorf | 13527550 | SmartBlock 1.5 mL |
| Tris | Milipore | 648311 | brand not critical |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | 100 mL, brand not critical |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | 25 mL, brand not critical |
References
- Berger, F. Emil Heitz, a true epigenetics pioneer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572 (2019).
- Irick, H. A new function for heterochromatin. Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).
- Kasinathan, B., et al. Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila. Elife. , 1-31 (2020).
- Lifschytz, E., Hareven, D. Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster. Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).
- Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
- Lee, Y. C. G., et al. Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin. PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).
- Koryakov, D. E., et al. The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster. Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).
- Cao, R., et al. Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing. Science. 298 (5595), 1039 (2002).
- Hines, K. A., et al. Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading. 遗传学. 182 (4), 967-977 (2009).
- Elgin, S. C. R., Reuter, G. Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).
- Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
- Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription. BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).
- Tennessen, J. M., Thummel, C. S. Coordinating growth and maturation – Insights from drosophila. Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).
- Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling. Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).
- Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
- Larson, A. G., Narlikar, G. J. The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation. 生物化学. 57 (17), 2540-2548 (2018).
- Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1α. Methods in Enzymology. , (2018).
- Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, a. J., Eissenberg, J. C. Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila. 遗传学. 155 (2), 699-708 (2000).
- Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster. Trends in Genetics. , (2019).
- Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
- Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
- Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes. Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).
- Kolesnikova, T. D., et al. Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene. Fly. 5 (3), 181-190 (2011).
- Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).
- Messina, G., et al. Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization. Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).
- Aguilar-Fuentes, J., et al. p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model. PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).
- Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes. Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).
- Farkaš, R., Mechler, B. M. The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response. Cell Death & Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).
- Zhang, P., Spradling, A. C. The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin. 遗传学. 139 (2), 659-670 (1995).
- Stormo, B. M., Fox, D. T. Polyteny: still a giant player in chromosome research. Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).
