Immunofluorescente kleuring voor visualisatie van heterochromatine geassocieerde eiwitten in drosophila speekselklieren

Summary

Dit protocol is bedoeld om heterochromatine aggregaten in Drosophila polytene cellen te visualiseren.

Abstract

Visualisatie van heterochromatineaggregaten door immunostaining kan een uitdaging zijn. Veel zoogdiercomponenten van chromatine worden bewaard in Drosophila melanogaster. Daarom is het een uitstekend model om de vorming en het onderhoud van heterochromatine tebestuderen. Gepolyteniseerde cellen, zoals die gevonden in speekselklieren van derde instar D. melanogaster larven, bieden een uitstekend hulpmiddel om de chromatine versterkt bijna duizend keer te observeren en hebben onderzoekers in staat gesteld om veranderingen in de verdeling van heterochromatine in de kern te bestuderen. Hoewel de observatie van heterochromatinecomponenten direct in polytene-chromosoompreparaten kan worden uitgevoerd, kan de lokalisatie van sommige eiwitten worden gewijzigd door de ernst van de behandeling. Daarom is de directe visualisatie van heterochromatine in cellen een aanvulling op dit type studie. In dit protocol beschrijven we de immunostainingtechnieken die voor dit weefsel worden gebruikt, het gebruik van secundaire fluorescerende antilichamen en confocale microscopie om deze heterochromatineaggregaten nauwkeuriger en gedetailleerder te observeren.

Introduction

Sinds de vroege studies van Emil Heitz¹wordt heterochromatine beschouwd als een belangrijke regulator van cellulaire processen zoals genexpressie, meiotische en mitotische scheiding van chromosomen en het behoud van genoomstabiliteit^2,3,4.

Heterochromatine is voornamelijk onderverdeeld in twee soorten: constitutieve heterochromatine die kenmerkend repetitieve sequenties definieert, en transponeerbare elementen die aanwezig zijn op specifieke chromosoomplaatsen zoals de telomeren en centromeren. Dit type heterochromatine wordt voornamelijk epigenetisch gedefinieerd door specifieke histontekens zoals de di- of trimethylatie van lysine 9 van histon H3 (H3K9me3) en de binding van het Heterochromatine-eiwit 1a (HP1a)^5,6. Aan de andere kant lokaliseert facultatieve heterochromatine zich via de armen van het chromosoom en bestaat het voornamelijk uit ontwikkelingsstiltegenen^7,8. Immunostaining van heterochromatineblokken in metafasecellen, of de observatie van heterochromatineaggregaten in interfasecellen, heeft veel licht onthuld in het begrip van de vorming en functie van heterochromatische gebieden⁹.

Het gebruik van Drosophila als modelsysteem heeft de ontwikkeling van essentiële instrumenten mogelijk maken om heterochromatine te bestuderen zonder het gebruik van elektronenmicroscopie¹⁰. Sinds de beschrijving van positie-effectvariëtatie en de ontdekking van heterochromatine-geassocieerde eiwitten, zoals HP1a, en histon post-translationele modificaties, hebben veel groepen verschillende immunohistochemische technieken ontwikkeld die visualisatie van deze heterochromatische gebieden^10,11mogelijk maken .

Deze technieken zijn gebaseerd op het gebruik van specifieke antilichamen die heterochromatine-geassocieerde eiwitten of histonen herkennen. Voor elk celtype en antilichaam moeten de fixatie- en permeabilisatieomstandigheden empirisch worden bepaald. Ook kunnen de omstandigheden variëren als aanvullende mechanische processen zoals squashtechnieken worden gebruikt. In dit protocol beschrijven we het gebruik van Drosophila speekselklieren om heterochromatische foci te bestuderen. Speekselklieren hebben gepolyteniseerde cellen die meer dan 1.000 kopieën van het genoom bevatten, waardoor een versterkt beeld wordt verkregen van de meeste chromatinekenmerken, met uitzondering van satelliet-DNA en sommige heterochromatische gebieden die worden gerepliceerd. Niettemin worden heterochromatinegebieden gemakkelijk gevisualiseerd in polytene-chromosoompreparaten, maar de squashtechnieken kunnen soms karakteristieke chromatinegebonden complexen of de chromatinearchitectuur verstoren. Daarom kan immunolokalisatie van eiwitten in het hele speekselklierweefsel deze ongewenste effecten overtreffen. We hebben dit protocol gebruikt om verschillende chromatine gebonden eiwitten te detecteren, en we hebben aangetoond dat dit protocol in combinatie met mutante Drosophila-voorraden kan worden gebruikt om heterochromatineverstoring te bestuderen¹².

Protocol

1. Derde instar larvencultuur Bereid 1 liter standaard media door toevoeging van 100 g gist, 100 g ongeraffineerde hele rietsuiker, 16 g agar, 10 ml propionzuur en 14 g gelatine. Los alle ingrediënten behalve de gist op in 800 ml leidingwater en los vervolgens de gist op. Autoclaaf onmiddellijk gedurende 30 minuten. Laat de media daarna afkoelen tot 60 °C en voeg propionzuur toe aan een eindconcentratie van 0,01%. Laat de fles staan tot de gelatine gevormd is. Om de 3o instar la…

Representative Results

Representatieve resultaten van HP1a immunostaining in drosophila speekselklieren zijn weergegeven in figuur 1. Een positief resultaat is het waarnemen van één brandpunt (figuur 1a) (heterochromatisch aggregaat of condensaat). Een negatief resultaat is geen signaal of een verspreid signaal. Soms kan een dubbel signaal worden waargenomen, dat wil zeggen met een dubbel punt(figuur 1c),maar het komt meestal in kleinere hoevee…

Discussion

De cellulaire functie van eukaryotische organismen kan de 3D-structuur in de kern definiëren, die wordt ondersteund door interacties tussen verschillende eiwitten met chromatine en verschillende moleculen, waaronder RNA. In de afgelopen drie jaar hebben de biologische condensaten die relevant zijn geweest, waaronder heterochromatine, een fundamentele rol gespeeld bij de bepaling van de fasescheiding ter bevordering van de afzonderlijke nucleaire ruimtelijke organisatie van actief en repressief chromatine <sup class="xre…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes	Axygen MCT-150-C	11351904	brand not critical
16% formaldehyde	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, Molecular Biology Grade	Roche	10735078001	brand not critical
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors	Merck	5892953001
Coverslip	Corning	CLS285022-200EA	22×22, brand not critical
DTT	Sigma	d9779	brand not critical
EDTA	Sigma	E5134	brand not critical
EGTA			brand not critical
Glass slide	Gold seal	3011	brand not critical
H3BO3	Baker	0084-01	brand not critical
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Product Form Concentrate 0.1 mL
KCl	Baker	3040-01	brand not critical
Methanol	Baker	9070-03	brand not critical
NaCl	Sigma	71376	brand not critical
NaOH			brand not critical
PIPES			brand not critical
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1.5 mL
Tris	Milipore	648311	brand not critical
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, brand not critical
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710	25 mL, brand not critical