Dit protocol is bedoeld om heterochromatine aggregaten in Drosophila polytene cellen te visualiseren.
Visualisatie van heterochromatineaggregaten door immunostaining kan een uitdaging zijn. Veel zoogdiercomponenten van chromatine worden bewaard in Drosophila melanogaster. Daarom is het een uitstekend model om de vorming en het onderhoud van heterochromatine tebestuderen. Gepolyteniseerde cellen, zoals die gevonden in speekselklieren van derde instar D. melanogaster larven, bieden een uitstekend hulpmiddel om de chromatine versterkt bijna duizend keer te observeren en hebben onderzoekers in staat gesteld om veranderingen in de verdeling van heterochromatine in de kern te bestuderen. Hoewel de observatie van heterochromatinecomponenten direct in polytene-chromosoompreparaten kan worden uitgevoerd, kan de lokalisatie van sommige eiwitten worden gewijzigd door de ernst van de behandeling. Daarom is de directe visualisatie van heterochromatine in cellen een aanvulling op dit type studie. In dit protocol beschrijven we de immunostainingtechnieken die voor dit weefsel worden gebruikt, het gebruik van secundaire fluorescerende antilichamen en confocale microscopie om deze heterochromatineaggregaten nauwkeuriger en gedetailleerder te observeren.
Sinds de vroege studies van Emil Heitz1wordt heterochromatine beschouwd als een belangrijke regulator van cellulaire processen zoals genexpressie, meiotische en mitotische scheiding van chromosomen en het behoud van genoomstabiliteit2,3,4.
Heterochromatine is voornamelijk onderverdeeld in twee soorten: constitutieve heterochromatine die kenmerkend repetitieve sequenties definieert, en transponeerbare elementen die aanwezig zijn op specifieke chromosoomplaatsen zoals de telomeren en centromeren. Dit type heterochromatine wordt voornamelijk epigenetisch gedefinieerd door specifieke histontekens zoals de di- of trimethylatie van lysine 9 van histon H3 (H3K9me3) en de binding van het Heterochromatine-eiwit 1a (HP1a)5,6. Aan de andere kant lokaliseert facultatieve heterochromatine zich via de armen van het chromosoom en bestaat het voornamelijk uit ontwikkelingsstiltegenen7,8. Immunostaining van heterochromatineblokken in metafasecellen, of de observatie van heterochromatineaggregaten in interfasecellen, heeft veel licht onthuld in het begrip van de vorming en functie van heterochromatische gebieden9.
Het gebruik van Drosophila als modelsysteem heeft de ontwikkeling van essentiële instrumenten mogelijk maken om heterochromatine te bestuderen zonder het gebruik van elektronenmicroscopie10. Sinds de beschrijving van positie-effectvariëtatie en de ontdekking van heterochromatine-geassocieerde eiwitten, zoals HP1a, en histon post-translationele modificaties, hebben veel groepen verschillende immunohistochemische technieken ontwikkeld die visualisatie van deze heterochromatische gebieden10,11mogelijk maken .
Deze technieken zijn gebaseerd op het gebruik van specifieke antilichamen die heterochromatine-geassocieerde eiwitten of histonen herkennen. Voor elk celtype en antilichaam moeten de fixatie- en permeabilisatieomstandigheden empirisch worden bepaald. Ook kunnen de omstandigheden variëren als aanvullende mechanische processen zoals squashtechnieken worden gebruikt. In dit protocol beschrijven we het gebruik van Drosophila speekselklieren om heterochromatische foci te bestuderen. Speekselklieren hebben gepolyteniseerde cellen die meer dan 1.000 kopieën van het genoom bevatten, waardoor een versterkt beeld wordt verkregen van de meeste chromatinekenmerken, met uitzondering van satelliet-DNA en sommige heterochromatische gebieden die worden gerepliceerd. Niettemin worden heterochromatinegebieden gemakkelijk gevisualiseerd in polytene-chromosoompreparaten, maar de squashtechnieken kunnen soms karakteristieke chromatinegebonden complexen of de chromatinearchitectuur verstoren. Daarom kan immunolokalisatie van eiwitten in het hele speekselklierweefsel deze ongewenste effecten overtreffen. We hebben dit protocol gebruikt om verschillende chromatine gebonden eiwitten te detecteren, en we hebben aangetoond dat dit protocol in combinatie met mutante Drosophila-voorraden kan worden gebruikt om heterochromatineverstoring te bestuderen12.
De cellulaire functie van eukaryotische organismen kan de 3D-structuur in de kern definiëren, die wordt ondersteund door interacties tussen verschillende eiwitten met chromatine en verschillende moleculen, waaronder RNA. In de afgelopen drie jaar hebben de biologische condensaten die relevant zijn geweest, waaronder heterochromatine, een fundamentele rol gespeeld bij de bepaling van de fasescheiding ter bevordering van de afzonderlijke nucleaire ruimtelijke organisatie van actief en repressief chromatine <sup class="xre…
The authors have nothing to disclose.
We danken Marco Antonio Rosales Vega en Abel Segura voor het maken van enkele confocale beelden, Carmen Muñoz voor mediavoorbereiding en Dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui en Dr. Chris Wood van het LMNA voor advies over het gebruik van de microscopen.
1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen MCT-150-C | 11351904 | brand not critical |
16% formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
AF1 Citifluor | Ted pella | 19470 | 25 mL |
BSA, Molecular Biology Grade | Roche | 10735078001 | brand not critical |
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors |
Merck | 5892953001 | |
Coverslip | Corning | CLS285022-200EA | 22×22, brand not critical |
DTT | Sigma | d9779 | brand not critical |
EDTA | Sigma | E5134 | brand not critical |
EGTA | brand not critical | ||
Glass slide | Gold seal | 3011 | brand not critical |
H3BO3 | Baker | 0084-01 | brand not critical |
H3K9me3 | Abcam | 8889 | |
HP1a | Hybridoma Bank | C1A9 | Product Form Concentrate 0.1 mL |
KCl | Baker | 3040-01 | brand not critical |
Methanol | Baker | 9070-03 | brand not critical |
NaCl | Sigma | 71376 | brand not critical |
NaOH | brand not critical | ||
PIPES | brand not critical | ||
Rotator | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Labquake Tube Shaker |
Thermo Mixer C | Eppendorf | 13527550 | SmartBlock 1.5 mL |
Tris | Milipore | 648311 | brand not critical |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | 100 mL, brand not critical |
β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | 25 mL, brand not critical |