使用基于HiBiT的生物报告器检测SARS-CoV-2受体结合域抗体
Summary
概述的方案描述了生产HiBiT受体结合结构域蛋白复合物的程序及其在快速灵敏地检测SARS-CoV-2抗体中的应用。
Abstract
COVID-19大流行的出现增加了对更好的血清学检测方法的需求，以确定严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的流行病学影响。越来越多的SARS-CoV-2感染增加了对更好的抗体检测检测的需求。目前的抗体检测方法在速度方面会损害灵敏度，或者灵敏度高但耗时。很大比例的SARS-CoV-2中和抗体靶向受体结合域（RBD），这是SARS-CoV-2的主要免疫原性区室之一。我们最近设计并开发了一种高度灵敏的生物发光标记RBD（NanoLuc HiBiT-RBD）来检测SARS-CoV-2抗体。以下文本描述了产生HiBiT-RBD复合物的过程以及使用此工具评估RBD靶向抗体存在的快速测定。由于HiBiT-RBD蛋白产品在很宽的温度范围内具有耐用性，并且实验过程更短，可以在1小时内完成，因此可以考虑将该方案视为检测患者血清样品中SARS-CoV-2抗体的更有效的替代方案。
Introduction
截至20212年3月30日，最近出现的新型冠状病毒SARS-CoV21已造成超过2，800，000人死亡和1.28亿感染。由于缺乏可靠且完善的SARS-CoV-2临床治疗程序，因此已经做出了许多努力来限制进一步的病毒传播，更重要的是，开发一种有效而强大的治疗方法或疫苗3。迄今为止，世界卫生组织报告的试验中已有50多种COVID-19候选疫苗4。检测针对SARS-CoV-2的抗体对于确定接种疫苗后体液反应的长期稳定性以及COVID-195康复患者至关重要。一些研究表明，恢复的SARS-CoV-2患者有可能在1年后失去大部分RBD结合抗体5，6，7，8，9。需要进一步研究以更好地了解持久的免疫力，更灵敏的抗体检测平台可以帮助进一步开展此类工作。轻度SARS-CoV-2感染持续免疫的报告表明长期抗体反应，也是一个有趣且有价值的研究领域。快速准确的检测方法对于监测个体血清中的抗体以提供更多关于人群中免疫力的信息至关重要。
与其他冠状病毒一样，SARS-CoV-2使用突出的刺突糖蛋白与血管紧张素转换酶-2（ACE2）结合，引发一系列事件，导致病毒和细胞膜融合6，7。最近有几项研究证明，Spike蛋白的RBD在引发针对SARS-CoV28，9，10，11的强大和特异性抗体反应方面起着至关重要的作用。特别是，Premkumar等人观察到的RBD结合抗体滴度与患者血浆的SARS-CoV-2中和效力之间的相关性与RBD是病毒结构的免疫原性区室9一致。考虑到这一点，许多可用于SARS-CoV-2抗体检测的诊断测试都是时间和成本密集型的，需要漫长的孵育和洗涤过程（酶联免疫吸附测定[ELISA]），或缺乏敏感性和准确性（侧流免疫测定[LFIA]）12。因此，一种具有高灵敏度、快速反应和相对低成本的COVID-19衍生抗体检测的定量和快速互补血清学方法，将满足对SARS-CoV-2流行病学监测的可靠血清学检测的需求。
总的来说，当前血清学检测的局限性促使人们研究生物发光报告系统作为未来血清测量中的潜在诊断剂。生物发光是一种天然存在的酶/底物反应，具有光发射。Nanoluc萤光素酶是最小的（19 kDa），但与 Renilla 和萤火虫荧光素酶（分别为36 kDa和61 kDa）相比是最亮的系统13，14。此外，Nanoluc在前面提到的系统中具有最高的信噪比和稳定性。Nanoluc的高信号强度支持检测非常低量的报告聚变15。Nanoluc二进制技术（NanoBiT）是Nanoluc系统的分裂版本，它由两个部分组成：小BiT（11个氨基酸;SmBiT）和具有相对低亲和力相互作用（KD = 190μM）的大型BiT（LgBiT）形成发光配合物16。NanoBiT广泛用于涉及鉴定蛋白质 – 蛋白质相互作用的各种研究15，17，18，19 和细胞信号通路11，20，21。
最近，引入了另一种对LgBiT具有明显更高亲和力的小肽（KD = 0.7 nM），即HiBiT Nano-Glo系统，以代替SmBiT。Nano-Glo”添加-混合-读取”测定的高亲和力和强信号使HiBiT成为一种合适的定量发光肽标签。在这种方法中，HiBiT标签通过开发一种施加最小结构干扰的构建体附加到靶蛋白上。HiBiT蛋白融合将主动与LgBiT对应物结合，产生高活性荧光素酶，在检测试剂存在下产生可检测的生物发光（图1）。同样，我们开发了一种基于HiBiT Nano-Glo的系统，可以很容易地测量SARS-CoV-2回收个体血清中的中和抗体滴度，最近还开发了一种HiBiT标记的SARS-CoV-2 RBD。本文描述了使用标准实验室程序和设备生产HiBiT-RBD生物报告仪的方案，并展示了该生物报告书如何用于快速有效的检测中以检测SARS-CoV-2 RBD靶向抗体。
Protocol
注意：下面描述的协议符合协议代码20200371-01H的所有道德准则。 1. HiBiT-RBD生物报告仪的生产和评估 生产足够数量的HiBiT-RBD生物报告机 准备细胞培养 准备含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的完整Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）。然后，在37°C水浴中加热培养基。 打开生物安全柜（BSC），并使用70%v / v乙醇对柜表面进行灭菌。 培养细?…
Representative Results
记录来自含有HiBit-RBD的细胞裂解物和转染细胞上清液的信号（图2）以评估适当的蛋白质来源。HiBiT-RBD和LgBit分别用作对照，当两个部分组合时，数据显示与强信号相比，背景较低。因此，HiBiT-RBD与LgBiT的相互作用对于产生用于底物消化和生物发光活性的活性酶是必要的（图1）。 添加蛋白G将有助于抗体沉淀（图3</stro…
Discussion
感染SARS-CoV-2的人数不断增加，全球疫苗接种工作不断进行，因此需要进行灵敏和快速的血清学检测，这些检测可用于大规模血清调查。最近的研究表明，基于分裂纳米荧光素酶的生物报告人可用于开发此类测定。我们最近开发了HiBiT-RBD生物报告程序，以设计一种可用于以快速可靠的方式检测患者血清中SARS-CoV-2特异性抗体的测试（图4C）。
该测定中有几?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢何晓红、里卡多·马吕斯、朱莉娅·佩特里克、布拉德利·奥斯汀和克里斯蒂安诺·塔内塞·德索萨的技术援助。我们也感谢Mina Ghahremani的平面设计。我们还要感谢所有参与并为这项研究捐献血液样本的个人。DWC部分由uOttawa Faculty和 Department of Medicine 提供支持。
Materials
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga 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| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
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Cite This Article
Rezaei, R., Surendran, A., Singaravelu, R., Jamieson, T. R., Taklifi, P., Poutou, J., Azad, T., Ilkow, C. S. Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter. J. Vis. Exp. (174), e62488, doi:10.3791/62488 (2021).