HiBiTベースバイオレポーターを用いたSARS-CoV-2受容体結合ドメイン抗体の検出
Summary
概説されたプロトコルは、HiBiT受容体結合ドメインタンパク質複合体を産生するための手順と、SARS-CoV-2抗体の迅速かつ感度的な検出のためのその応用について説明する。
Abstract
COVID-19パンデミックの出現は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)の疫学的影響を決定するためのより良い血清学的検出方法の必要性を高めている。SARS-CoV-2感染の増加は、より良い抗体検出アッセイの必要性を高める。現在の抗体検出方法は、速度に対する感度を損なうか、感度は高いが時間がかかります。SARS-CoV-2中和抗体の大部分は、SARS-CoV-2の一次免疫原性コンパートメントの1つである受容体結合ドメイン(RBD)を標的とする。我々は最近、SARS-CoV-2抗体を検出するために、高感度な生物発光タグ付きRBD(NanoLuc HiBiT-RBD)を設計し、開発しました。以下のテキストは、このツールを用いてRBD標的抗体の存在を評価するHiBiT-RBD複合体および高速アッセイを製造する手順を説明する。HiBiT-RBDタンパク質製品の耐久性が広い温度で、1時間以内に完了できる短い実験手順のために、このプロトコルは患者血清サンプル中のSARS-CoV-2抗体を検出するより効率的な代替手段として考えることができます。
Introduction
最近の新しいコロナウイルスSARS-CoV21の出現により、2012年3月30日時点で2,800,000人以上の死亡者と1億2,800万人の感染が発生しました。SARS-CoV-2臨床療法のための信頼でき、確立された処置の欠如のために、より重要な効果的で強い処置またはワクチン3を開発するために、さらなるウイルス伝達を制限するために多くの努力がなされてきた。現在までに、世界保健機関(WHO4)が報告した試験には、50人以上のCOVID-19ワクチン候補があります。SARS-CoV-2に対する抗体の検出は、COVID-195の回復された患者において、ワクチンの投与時の液性応答の長期安定性を決定するために最も重要である。いくつかの研究は、回復したSARS-CoV-2患者が1年後にRBD結合抗体のほとんどを失う可能性があることを実証した5、6、7、8、9。永続的な免疫をよりよく理解するためにさらなる調査が必要であり、より敏感な抗体検出プラットフォームは、そのような作業をさらに助けることができます。長期抗体応答を示唆する軽度のSARS-CoV-2感染の持続的免疫の報告も興味深く、価値のある研究分野である。迅速かつ正確な検出方法は、集団の免疫に関するより多くの情報を提供するために、個人のセラの抗体を監視するために不可欠です。
他のコロナウイルスと同様に、SARS-CoV-2は突出したスパイク糖タンパク質を使用してアンジオテンシン変換酵素-2(ACE2)に結合し、ウイルス膜と細胞膜の融合につながるイベントのカスケードを開始する6,7。いくつかの研究は最近、スパイクタンパク質のRBDがSARS-CoV28,9,10,11に対する強力かつ特異的な抗体応答を引き出す上で重要な役割を果たすことを証明した。特に、RbD結合抗体の力価と患者の血漿中性SARS-CoV-2中和力との間にPremkumarらによって観察される相関は、RBDがウイルス構造の免疫原性コンパートメントであることと一致する。そのことを念頭に置いて、SARS-CoV-2抗体検出に利用可能な多くの診断テストは、時間とコストを要する、インキュベーションおよび洗浄(酵素結合免疫吸着アッセイ[ELISA])、または感度と精度(横流免疫測定[LFIA])12の長い手順を必要とする。したがって、高感度、高速応答、および比較的低コストのCOVID-19由来抗体検出の定量的かつ迅速な相補血清学的方法は、SARS-CoV-2疫学的サーベイランスのための信頼性の高い血清学的検査の必要性に役立ちます。
総称して、現在の血清学的アッセイの限界は、将来の血清調査における潜在的な診断薬としての生物発光報告システムの調査を促した。生物発光は、自然に発生する酵素/基質反応であり、発光を伴います。ナノルクルシメラーゼは最も小さい(19kDa)でありながら、レニラとホタルルシファーゼ(それぞれ36kDaと61kDa)に比べて最も明るいシステムです13,14。さらに、Nanolucは前述のシステムの中で最も高い信号対雑音比および安定性を有する。ナノルクの高い信号強度は、レポーター融合15の非常に少量の検出をサポートしています。ナノルクバイナリテクノロジー(NanoBiT)は、2つのセグメントで構成されているNanolucシステムの分割版です: 小さなBiT (11アミノ酸;SmBiT)および比較的低親和性相互作用を有する大型BiT(LgBiT)(KD = 190 μM)を有し、発光複合体16を形成する。NanoBiTは、タンパク質相互作用の同定15、17、18、19および細胞シグナル伝達経路11,20,21の様々な研究で広く使用されています。
最近、LgBiT(KD = 0.7 nM)に対する明らかに高い親和性を有する別の小さなペプチド、すなわち、SmBiTの代わりにHiBiTナノグロ系が導入された。Nano-Gloの「付加ミックス読み取り」アッセイの高い親和性と強いシグナルは、HiBiTを適切な定量的で発光性ペプチドタグにします。このアプローチでは、HiBiTタグは、最小限の構造干渉を課す構造を開発することによって標的タンパク質に付加される。HiBiTタンパク質融合は、LgBiTの対応物に積極的に結合し、検出試薬の存在下で検出可能な生物発光を生成する高活性ルシファーゼ酵素を産生する(図1)。同様に、SARS-CoV-2回収された個体のセラ中の中和抗体力素を容易に測定するHiBiT Nano-Gloベースのシステムを開発し、最近HiBiTタグ付きSARS-CoV-2 RBDを開発しました。本論文では、標準的な実験手順と装置を用いてHiBiT-RBDバイオレポーターを製造するためのプロトコルについて述べ、このバイオレポーターをSARS-CoV-2 RBD標的抗体を検出するための迅速かつ効率的なアッセイで使用する方法を示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
SARS-CoV-2に感染する人が増え、世界的なワクチン接種に取り組むには、大規模な血清調査で使用できる敏感で速い血清学的検査が必要です。最近の研究では、分割ナノルシメラーゼベースのバイオレポーターを使用してアッセイを開発できることが示されています。最近、HiBiT-RBDバイオレポーターを開発し、患者血清中のSARS-CoV-2特異的抗体を迅速かつ信頼性の高い方法で検出するためのテス?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
シャオホン・ヘ、リカルド・マリウス、ジュリア・ペトリク、ブラッドリー・オースティン、クリスティアーノ・タネーゼ・デ・ソウザの技術支援に感謝し、感謝します。また、グラフィックデザインのためにミナ・ガーレマニに感謝します。また、この研究のために血液サンプルを参加し、寄付したすべての人に感謝したいと思います。DWCは、uOttawaの教員と医学部によって部分的にサポートされています。
Materials
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga 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| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
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