Micro-injectie methode voor Anopheles gambiae embryo's
Summary
Micro-injectietechnieken zijn essentieel om exogene genen in het genoom van muggen te introduceren. Dit protocol verklaart een methode die door het James-laboratorium wordt gebruikt om DNA-constructies in Anopheles gambiae-embryo’s te micro-injecteren om getransformeerde muggen te genereren.
Abstract
Embryo micro-injectie technieken zijn essentieel voor vele moleculaire en genetische studies van insectensoorten. Ze bieden een middel om exogene DNA-fragmenten die coderen voor genen van belang en gunstige eigenschappen op een stabiele en erfelijke manier in de kiembaan van insecten te introduceren. De resulterende transgene stammen kunnen worden bestudeerd voor fenotypische veranderingen als gevolg van de expressie van het geïntegreerde DNA om basisvragen te beantwoorden of worden gebruikt in praktische toepassingen. Hoewel de technologie eenvoudig is, vereist het van de onderzoeker geduld en oefening om een vaardigheidsniveau te bereiken dat de efficiëntie maximaliseert. Hier afgebeeld is een methode voor micro-injectie van embryo’s van de Afrikaanse malariamug, Anopheles gambiae. Het doel is om door middel van micro-injectie exogene DNA aan het embryo af te leveren, zodat het kan worden opgenomen in de zich ontwikkelende kiembaan (pool) cellen. Expressie uit het geïnjecteerde DNA van transposasen, integrasen, recombinases of andere nucleasen (bijvoorbeeld CRISPR-geassocieerde eiwitten, Cas) kan gebeurtenissen veroorzaken die leiden tot de covalente insertie in chromosomen. Transgene An. gambiae gegenereerd uit deze technologieën zijn gebruikt voor basisstudies van componenten van het immuunsysteem, genen die betrokken zijn bij bloedvoeding en elementen van het reuksysteem. Bovendien zijn deze technieken gebruikt om An. gambiae-stammen te produceren met eigenschappen die kunnen helpen de overdracht van malariaparasieten onder controle te houden.
Introduction
Micro-injectietechnieken worden sinds de vroege jaren 1900 gebruikt om organismen experimenteel te manipuleren1. Micro-injectie is gebruikt om zowel biologische basisfuncties te bestuderen als /of belangrijke veranderingen in de biologie van een gewenst organisme aan te brengen. De micro-injectietechniek is van bijzonder belang geweest voor vectorbiologen en is veel gebruikt om vectorgenomen2-11te manipuleren. Transgenese-experimenten in geleedpotige vectoren zijn vaak bedoeld om vectoren minder efficiënt te maken in het overbrengen van pathogenen door veranderingen door te voeren die de fitheid van een vector verminderen of de refractie verhogen voor de pathogenen die ze overbrengen. Muggen brengen een verscheidenheid aan menselijke ziekteverwekkers over en hebben een aanzienlijke impact op de morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Het geslacht Van muggen anopheles brengt de menselijke malariaparasitaire pathogenen, Plasmodium spp, over. Genetische manipulatie-experimenten met Anopheles hebben tot doel de biologie beter te begrijpen en de vectoriële capaciteit van deze muggen te verminderen in pogingen om nieuwe malaria-eliminatiestrategieën te ontwikkelen.
De muggenvectoren die wereldwijd de meeste malaria-infecties veroorzaken, bevinden zich in het Anopheles gambiae-soortencomplex. De meeste succesvolle transgenese-experimenten zijn echter uitgevoerd op de malariavector van het Indiase subcontinent, Anopheles stephensi. Hoewel er veel laboratorium-aangepaste Anopheles gambiae stammen bestaan, is het aantal transgene Anopheles gambiae spp. lijnen gerapporteerd in de literatuur niet te vergelijken met dat van Anopheles stephensi. Er wordt gedacht dat het Anopheles gambiae embryo moeilijker te injecteren is en succesvolle transgenese bereikt dan Anopheles stephensi, hoewel de redenen voor deze verschillen onbekend zijn. Dit protocol beschrijft een methode waarvan bewezen is dat deze consistent succesvol is in het bereiken van transgenese van Anopheles gambiae embryo’s via micro-injectie. Het protocol is gebaseerd op een methode die eerder is ontwikkeld door Hervé Bossin en Mark Benedict12 met enkele aanvullende details en wijzigingen die zijn toegevoegd die de efficiëntie van transgenese blijken te verhogen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met de toegenomen beschikbaarheid van nauwkeurige en flexibele genetische manipulatietechnologieën zoals CRISPR/Cas9 kunnen transgene organismen op een eenvoudigere en stabielere manier worden ontwikkeld dan voorheen mogelijk was. Deze tools hebben onderzoekers in staat gesteld om transgene stammen van muggenvectoren te creëren die zeer dicht bij het bereiken van de gewenste eigenschappen van refractie voor pathogenen (populatiemodificatie) of erfelijke steriliteit (populatieonderdrukking) liggen. Om echter de meest ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell en Madeline Nottoli dankbaar voor de muggenhouderij. Financiering werd verstrekt door de Universiteit van Californië, Irvine Malaria Initiative. AAJ is een Donald Bren Professor aan de Universiteit van Californië, Irvine.
Materials
| 10x Microinjection Buffer | – | – | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2×1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75×26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60×15 mm, 90×15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C., Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. , (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
