Summary

Mikroinjektionsmethode für Anopheles gambiae Embryonen

Published: July 07, 2021
doi:

Summary

Mikroinjektionstechniken sind unerlässlich, um exogene Gene in die Genome von Moskitos einzuführen. Dieses Protokoll erklärt eine Methode, die vom James-Labor verwendet wird, um DNA-Konstrukte in Anopheles gambiae-Embryonen zu mikroinjizieren, um transformierte Moskitos zu erzeugen.

Abstract

Embryo-Mikroinjektionstechniken sind für viele molekulare und genetische Studien von Insektenarten unerlässlich. Sie bieten ein Mittel, um exogene DNA-Fragmente, die für interessante Gene sowie günstige Merkmale kodieren, stabil und vererbbar in die Keimbahn des Insekts einzuführen. Die resultierenden transgenen Stämme können auf phänotypische Veränderungen untersucht werden, die sich aus der Expression der integrierten DNA ergeben, um grundlegende Fragen zu beantworten oder in praktischen Anwendungen verwendet zu werden. Obwohl die Technologie unkompliziert ist, erfordert sie vom Ermittler Geduld und Übung, um ein Maß an Fähigkeiten zu erreichen, das die Effizienz maximiert. Hier ist eine Methode zur Mikroinjektion von Embryonen der afrikanischen Malariamücke, Anopheles gambiae, gezeigt. Ziel ist es, durch Mikroinjektion exogene DNA an den Embryo abzugeben, so dass sie in den sich entwickelnden Keimbahnzellen (Polzellen) aufgenommen werden kann. Die Expression von Transposasen, Integrasen, Rekombinasen oder anderen Nukleasen (z. B. CRISPR-assoziierte Proteine, Cas) aus der injizierten DNA kann Ereignisse auslösen, die zu ihrer kovalenten Insertion in Chromosomen führen. Transgene An. gambiae, die aus diesen Technologien erzeugt werden, wurden für grundlegende Studien von Komponenten des Immunsystems, Genen, die an der Bluternährung beteiligt sind, und Elementen des olfaktorischen Systems verwendet. Darüber hinaus wurden diese Techniken verwendet, um An. gambiae-Stämme mit Merkmalen herzustellen, die dazu beitragen können, die Übertragung von Malariaparasiten zu kontrollieren.

Introduction

Mikroinjektionstechniken werden seit den frühen 1900er Jahren verwendet, um Organismen experimentell zu manipulieren1. Die Mikroinjektion wurde verwendet, um sowohl grundlegende biologische Funktionen zu untersuchen als auch / oder wichtige Veränderungen in der Biologie eines gewünschten Organismus einzuführen. Die Mikroinjektionstechnik war für Vektorbiologen von besonderem Interesse und wurde häufig zur Manipulation von Vektorgenomen2-11eingesetzt. Transgenese-Experimente an Arthropodenvektoren zielen oft darauf ab, Vektoren bei der Übertragung von Krankheitserregern weniger effizient zu machen, indem sie entweder Änderungen vornehmen, die die Fitness eines Vektors verringern, oder die Refraktivität gegenüber den von ihnen übertragenen Krankheitserregern erhöhen. Mücken übertragen eine Vielzahl von menschlichen Krankheitserregern und haben weltweit einen erheblichen Einfluss auf Morbidität und Mortalität. Die Anopheles-Mückengattung überträgt die parasitären Erreger Plasmodium spp. Gentechnische Experimente mit Anopheles zielten darauf ab, die Biologie besser zu verstehen und die vektorielle Kapazität dieser Moskitos zu reduzieren, um neuartige Strategien zur Eliminierung von Malaria zu entwickeln.

Die Mückenvektoren, die weltweit die meisten Malariainfektionen verursachen, befinden sich im Anopheles gambiae-Artenkomplex. Die meisten erfolgreichen Transgenese-Experimente wurden jedoch am Malaria-Vektor des indischen Subkontinents, Anopheles stephensi,durchgeführt. Während es viele laborangepasste Anopheles gambiae-Stämme gibt, ist die Anzahl der transgenen Anopheles gambiae spp.-Linien, die in der Literatur berichtet werden, nicht mit der von Anopheles stephensivergleichbar. Es wird angenommen, dass der Embryo von Anopheles gambiae schwieriger zu injizieren und eine erfolgreiche Transgenese zu erreichen ist als Anopheles stephensi, obwohl die Gründe für diese Unterschiede unbekannt sind. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die sich bei der Transgenese von Anopheles gambiae-Embryonen durch Mikroinjektion als durchgängig erfolgreich erwiesen hat. Das Protokoll basiert auf einer Methode, die zuvor von Hervé Bossin und Mark Benedict12 entwickelt wurde, wobei einige zusätzliche Details und Änderungen hinzugefügt wurden, die die Effizienz der Transgenese erhöhen.

Protocol

1. Moskitos für die Mikroinjektion vorbereiten Säen Sie einenKäfig 13 (~ 5000 cm3)mit ~ 100 männlichen und 200-300 weiblichen 1-2 Tage erwachsenen Mücken nach der Eklosion und lassen Sie sie sich für 2 Tage paaren. Nach der Paarungszeit stellen Sie den Moskitos eine Blutmahlzeit mit entweder 2 ml Blut mit einem künstlichen Fütterungsgerät oder lebenden betäubten Tieren zur Verfügung, abhängig von den Insektationspraktiken14. Am nä…

Representative Results

Ein repräsentatives Beispiel für die Anwendung des beschriebenen Mikroinjektionsprotokolls findet sich in Carballar-Lejarazú et al5. Die Absicht dabei war, ein autonomes Gene-Drive-System in die Keimbahn eines Laborstamms, G3, von An. gambiaeeinzufügen. Das System wurde entwickelt, um den Kardinalortholog locus (Agcd) auf dem dritten Chromosom dieser Spezies anzusprechen, der für eine Hämperoxidase kodiert, die die Umwandlung von 3-Hydroxykynurenin in Xanthommatin …

Discussion

Mit der erhöhten Verfügbarkeit präziser und flexibler gentechnischer Technologien wie CRISPR/Cas9 können transgene Organismen einfacher und stabiler als bisher entwickelt werden. Diese Werkzeuge haben es den Forschern ermöglicht, transgene Stämme von Mückenvektoren zu erzeugen, die den gewünschten Eigenschaften der Refraktärität gegenüber Krankheitserregern (Populationsmodifikation) oder der vererbbaren Sterilität (Populationsunterdrückung) sehr nahe kommen. Um jedoch möglichst sichere und stabilste gentech…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell und Madeline Nottoli für die Mückenhaltung. Die Finanzierung erfolgte durch die University of California, Irvine Malaria Initiative. AAJ ist Donald Bren Professor an der University of California, Irvine.

Materials

10x Microinjection Buffer 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl
Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) Bio-Rad Neatly and straightly cut into 2×1 cm piece
Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) Fisher Brand Ends cut
De-ionized or double-distilled water (ddH20)  Mili-Q In a wash bottle 
Dissecting microscope  Leica  Leica MZ12 For embryo alignment
Forceps  No. 5 size 
Glass container  Pyrex No. 3140 125 x 65
Glass slide  Fisher Brand No. 12-549-3 75×26 mm
Incubator Barnsted Lab-line Model No. 150 28 °C
KCl 50 mM
Latex dental film  Crosstex International No. 19302
Microinjector Sutter Instrument XenoWorks Digital Microinjector
Microloader Pipette tips  Eppendorf  20 µL microloader epT.I.P.S.
Micromanipulator Sutter Instrument XenoWorks Micromanipulator
Micropipette  Rainin  20 µL
Micropipette puller  Sutter Instrument Sutter P-2000 micropipette puller
Microscope  Leica DM 1000 LED or M165 FC For microinjection
Minimum fiber filter paper  Fisher Brand No. 05-714-4 Chromatography Paper, Thick 
Mosquitoes  MR4, BEI Resources Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion
NaHPO4 buffer  1 mM, ph 6.8
Nylon mesh
Paint brush Blick No. 05831-7040 Fine, size 4/0
Petri dish Plastic, (60×15 mm, 90×15 mm)
Sodium acetate  3M
Quartz glass capillaries  Sutter Instrument No. QF100-70-10 With filament, 1 mm OD,  ID 0.7 10 cm length
Water PCR grade  Roche No. 03315843001

References

  1. Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C., Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. , (1999).
  2. Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
  3. Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
  4. Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
  5. Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
  6. Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
  7. Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
  8. Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
  9. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  10. Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
  11. Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
  12. Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , (2015).
  13. Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
  14. Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
  15. Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).

Play Video

Cite This Article
Carballar-Lejarazú, R., Tushar, T., Pham, T. B., James, A. A. Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos. J. Vis. Exp. (173), e62591, doi:10.3791/62591 (2021).

View Video