שיטת מיקרו-ג'ק-קציה לעוברי אנופלס גמביה
Summary
טכניקות מיקרו-ג’ק-קציה חיוניות כדי להכניס גנים אקסוגניים לגנומים של יתושים. פרוטוקול זה מסביר שיטה המשמשת את מעבדת ג’יימס למיקרו-המצאת מבני DNA לעוברי אנופלס גמביה כדי ליצור יתושים שעברו טרנספורמציה.
Abstract
טכניקות מיקרו-הנדסה עובריות חיוניות למחקרים מולקולריים וגנטיים רבים של מיני חרקים. הם מספקים אמצעי להכניס שברי DNA אקסוגניים קידוד גנים של עניין, כמו גם תכונות חיוביות לתוך נבט חרקים בצורה יציבה תורשתית. זנים מהונדסים וכתוצאה מכך ניתן ללמוד עבור שינויים פנוטיפיים הנובעים הביטוי של ה- DNA המשולב כדי לענות על שאלות בסיסיות או בשימוש ביישומים מעשיים. למרות שהטכנולוגיה פשוטה, היא דורשת מהחוקר סבלנות ותרגול כדי להשיג רמה של מיומנות שממקסמת את היעילות. מוצג כאן שיטה למיקרו-ג’ק-קציה של עוברים של יתוש המלריה האפריקאי, אנופלס גמביה. המטרה היא לספק על ידי DNA אקסוגניים מיקרו-אינטג’ק לעובר, כך שניתן יהיה לקחת אותו בתאי הנבט המתפתחים (מוט). ביטוי מהדנ”א המוזרק של טרנספוזות, integrases, רקומבינות או גרעינים אחרים (לדוגמה חלבונים הקשורים CRISPR, Cas) יכול לעורר אירועים שמובילים להכנסה קוולנטית שלה לכרומוזומים. גמביה מהונדסת שנוצרה מטכנולוגיות אלה שימשה למחקרים בסיסיים של רכיבי מערכת החיסון, גנים המעורבים בהאכלת דם ואלמנטים של מערכת הריח. בנוסף, טכניקות אלה שימשו לייצור זני An. gambiae עם תכונות שעשויות לעזור לשלוט בהעברת טפילים מלריה.
Introduction
טכניקות מיקרו-ג’ק-קציה שימשו לתפעול ניסיוני של אורגניזמים מאז תחילת המאהה-20 . Microinjection שימש כדי ללמוד הן פונקציות ביולוגיות בסיסיות ו /או להציג שינויים חשובים בביולוגיה של אורגניזם הרצוי. טכניקת המיקרו-שיתוף הייתה מעניינת במיוחד ביולוגים וקטורים, והיא נמצאת בשימוש נרחב לתפעול גנומים וקטוריים2-11. ניסויי Transgenesis בווקטורים פרוקי רגליים לעתים קרובות שואפים להפוך וקטורים פחות יעילים בהעברת פתוגנים על ידי חקיקת שינויים שמקטינים את הכושר של וקטור או מגבירים את השחלה לפתוגנים שהם משדרים. יתושים מעבירים מגוון פתוגנים אנושיים ויש להם השפעה משמעותית על התחלואה והתמותה ברחבי העולם. סוג אנופלס של יתושים מעביר את הפתוגנים טפילים מלריה האנושית, פלסמודיום spp. ניסויים בהנדסה גנטית עם אנופלים נועדו להבין טוב יותר את הביולוגיה ולהפחית את היכולת הווקטורית של יתושים אלה במאמצים לפתח אסטרטגיות לחיסול מלריה חדשניות.
וקטורים יתושים התורמים ביותר זיהומים מלריה ברחבי העולם הם במתחם מינים אנופלס גמביה. עם זאת, רוב הניסויים הטרנסגנזה המוצלחים בוצעו על וקטור המלריה של תת היבשת ההודית, אנופלס סטיבנסי. בעוד שפע של זני אנופלס גמביה מותאמי מעבדה קיימים, מספר הקווים המהותניים של אנופלס גמביה spp. שדווחו בספרות אינו משתווה לזה של אנופלס סטיבנסי. הוא חשב כי אנופלס גמביה עובר קשה יותר להזריק ולהשיג טרנסגנזה מוצלחת מאשר אנופלס stephensi, אם כי הסיבות להבדלים אלה אינם ידועים. פרוטוקול זה מתאר שיטה שהוכח כי היא מצליחה בעקביות בהשגת טרנסגנזה של עוברים אנופלס גמביה באמצעות מיקרו-ינון. הפרוטוקול מבוסס על שיטה שפותחה בעבר על ידי הרה בוסין ומארק בנדיקט12 עם כמה פרטים נוספים ושינויים שנוספו שנמצאו כמגבירים את היעילות של transgenesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
עם הזמינות המוגברת של טכנולוגיות הנדסה גנטית מדויקות וגמישות כגון CRISPR/Cas9, ניתן לפתח אורגניזמים מהונדסים בצורה פשוטה ויציבה יותר ממה שאפשר בעבר. כלים אלה אפשרו לחוקרים ליצור זנים מהונדסים של וקטורים יתושים שקרובים מאוד להשגת התכונות הרצויות של השחלה לפתוגנים (שינוי אוכלוסין) או סטריליות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לדרוסילה סטילינג’ר, קיונה פרקר, פאריש פאוול ומדלין נוטולי על גידול יתושים. המימון ניתן על ידי אוניברסיטת קליפורניה, יוזמת מלריה אירוויין. AAJ הוא פרופסור דונלד ברן באוניברסיטת קליפורניה, אירווין.
Materials
| 10x Microinjection Buffer | – | – | 1 mM NaHPO4 buffer, pH 6.8, 50 mM KCl |
| Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane) | Bio-Rad | Neatly and straightly cut into 2×1 cm piece | |
| Conical tubes 50 ml (disposable centrifuge tube, polypropylene) | Fisher Brand | Ends cut | |
| De-ionized or double-distilled water (ddH20) | Mili-Q | In a wash bottle | |
| Dissecting microscope | Leica | Leica MZ12 | For embryo alignment |
| Forceps | No. 5 size | ||
| Glass container | Pyrex | No. 3140 | 125 x 65 |
| Glass slide | Fisher Brand | No. 12-549-3 | 75×26 mm |
| Incubator | Barnsted Lab-line | Model No. 150 | 28 °C |
| KCl | 50 mM | ||
| Latex dental film | Crosstex International | No. 19302 | |
| Microinjector | Sutter Instrument | XenoWorks Digital Microinjector | |
| Microloader Pipette tips | Eppendorf | 20 µL microloader epT.I.P.S. | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | XenoWorks Micromanipulator | |
| Micropipette | Rainin | 20 µL | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | Sutter P-2000 micropipette puller | |
| Microscope | Leica | DM 1000 LED or M165 FC | For microinjection |
| Minimum fiber filter paper | Fisher Brand | No. 05-714-4 | Chromatography Paper, Thick |
| Mosquitoes | MR4, BEI Resources | Anopheles gambiae, mated adult females, blood-fed 4-5 days post-eclosion | |
| NaHPO4 buffer | 1 mM, ph 6.8 | ||
| Nylon mesh | |||
| Paint brush | Blick | No. 05831-7040 | Fine, size 4/0 |
| Petri dish | Plastic, (60×15 mm, 90×15 mm) | ||
| Sodium acetate | 3M | ||
| Quartz glass capillaries | Sutter Instrument | No. QF100-70-10 | With filament, 1 mm OD, ID 0.7 10 cm length |
| Water PCR grade | Roche | No. 03315843001 |
References
- Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C., Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. Needle Microinjection: A Brief History. Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine. , (1999).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS One. 6 (1), 14587 (2011).
- Hammond, A., et al. CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Simões, M. L., et al. The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression. Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).
- Arik, A. J., et al. Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship. FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).
- Riabinina, O., et al. Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature Communications. 7, 13010 (2016).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles. Science Advances. 6 (20), (2020).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).
- Benedict, M. Q. Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos. BEI resources. , (2015).
- Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
- Benedict, M. Q., et al. Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti. PLoS One. 15 (3), 0221838 (2020).
- Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. Population modification of Anopheline species to control malaria transmission. Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).
