近接ライゲーションアッセイを用いた異流体せん断応力条件下でのTGFβ/BMP/SMADシグナル伝達の可視化と定量化
Summary
ここでは、病理的および生理的な流体せん断ストレス条件に曝露した内皮細胞における近接ライゲーションアッセイ(PLA)を用いて、複数のSMAD複合体を同時に可視化・解析するプロトコルを確立する。
Abstract
変形成長因子β(TGFβ)/骨形態形成タンパク質(BMP)シグナル伝達は、血管系の発達および恒常性の間に厳しく調節され、バランスがとれ、従って、このシグナル伝達経路の調節緩和は、肺動脈高血圧症、遺伝性血性動脈硬化症、アテローム硬化症などの重度の血管病理をもたらす。血管の最も内側の層として、血管内皮細胞(IC)は、常に流体せん断応力(SS)にさらされています。流体SSの異常パターンは、TGFβ/BMPシグナル伝達を増強することが示されており、これは、他の刺激と共に、アテローム発生を誘発する。これに関連して、アテローム化、低層SSは、アテロープロテクティブ、高層SS、このシグナル伝達を減少させながらTGFβ/ BMPシグナル伝達を強化することが判明した。これらの経路の活性化を効率的に解析するため、市販の空気圧ポンプシステムと近接ライゲーションアッセイ(PLA)を用いて、低層SSおよび高層SS条件下での転写因子複合体の形成を調査するワークフローを設計しました。
アクティブTGFβ/BMPシグナル伝達は、2つの調節SMAD(R-SMAD)からなる三量体SMAD複合体の形成を必要とする;共通のメディター SMAD (コ-SMAD;スマッド4)。三量体SMAD複合体の異なるサブユニット、すなわちR-SMAD/co-SMADまたはR-SMADまたはR-SMADのいずれかの異なるサブユニットを標的とするPLAを用いて、活性SMAD転写因子複合体の形成は、蛍光顕微鏡を用いて定量的および空間的に測定することができる。
連続で接続することができる6つの小さな並列チャネルを有するフロースライドの使用は、転写因子の複雑な形成および必要な制御の包含の調査を可能にする。
ここで説明するワークフローは、SMADの近接性を他の転写因子に対して対象とする研究や、異なる流体SS条件でSMAD以外の転写因子複合体に容易に適応させることができる。ここで示したワークフローは、定量的にも空間的にも、ECsにおける流体SS誘導TGFβ/BMPシグナリングを迅速かつ効果的に研究する方法を示しています。
Introduction
トランスフォーム成長因子β(TGFβ)スーパーファミリーのタンパク質は、TGFβs、骨形態形成タンパク質(BMP)、およびアクティビンズ1,2を含む様々なメンバーを有する多方性サイトカインである。リガンド結合は、リン酸化に至る受容体オリゴマーの形成を誘導し、それにより、細胞ゾーリック調節SMAD(R−SMAD)の活性化を行う。リガンドのサブファミリーに応じて、異なるR-SMAが活性化される1,2。TGFβsおよびアクチビンは主にSMAD2/3のリン酸化を誘導するが、BMPはSMAD1/5/8リン酸化を誘導する。しかし、BMPとTGFβs/アクティビンは、他のサブファミリーのR-SMAを活性化し、「横信号」3,4,5,6,7,8と呼ばれるプロセスで、SMAD1/5とSMAD2/3の両方からなる混合SMAD複合体があるという証拠が蓄積されています。.2つの活性化されたR-SMADは、その後、一般的なメディエーターSMAD4と三量体複合体を形成する。これらの転写因子複合体は、核に転写し、標的遺伝子の転写を調節することができる。SMADは、様々な転写共活性化因子および共抑制因子と相互作用し、標的遺伝子10を調節する可能性の多様化につながる。SMADシグナル伝達の調節緩和は、様々な疾患において深刻な影響を及ぼす。これに伴い、不均衡なTGFβ/BMPシグナル伝達は、肺動脈高血圧症、遺伝性出血性血管拡張症、またはアテローム性動脈硬化症3、11、12、13、14などの重度の血管病理を引き起こす可能性がある。
内皮細胞(ECs)は血管の最も内側の層を形成し、したがって、せん断応力(SS)に曝露され、血液の粘性流によって作用される摩擦力である。興味深いことに、高レベルの均一な層状SSにさらされる血管構造の一部に存在するECは、ホメオスタティックで静止状態に保たれています。対照的に、低い非均一なSSを経験するICは、例えば、大動脈弓の分岐またはより少ない湾曲において、増殖し、炎症経路を活性化する15。さらに、機能不全のICの部位はアテローム性動脈硬化症を発症しやすい。興味深いことに、これらのアテローム発生領域のICは、活性化されたSMAD2/3およびSMAD1/516,17,18の異常に高いレベルを表示します。この文脈において、増強されたTGFβ/BMPシグナル伝達は、アテローム硬化性病変19の発症における早期の事象であることが判明し、BMPシグナル伝達との干渉は、血管炎症、アテローム形成、および関連する石灰化20を著しく減少させることが判明した。
近接ライゲーションアッセイ(PLA)は、in situ21,22におけるタンパク質とタンパク質の相互作用を研究するための生化学的手法です。これは、目的の標的タンパク質を結合することができる異なる種の抗体の特異性に依存し、単一細胞レベルでの内因性タンパク質相互作用の高度に特異的な検出を可能にする。ここで、一次抗体は、検出23を可能にするために40nm未満の距離で標的エピトープに結合する必要がある。したがって、PLAは、内因性タンパク質相互作用を検出するために数百万個の細胞が必要な従来の共免疫沈降アプローチよりも非常に有益です。PLAでは、種特異的な二次抗体は、DNA断片(プラスおよびマイナスプローブと呼ぶ)に共有結合し、一次抗体に結合し、関心のあるタンパク質が相互作用する場合、プラスおよびマイナスプローブが近接して来る。DNAは次のステップで結紮され、円形DNAの転環増幅が可能になる。増幅の間、蛍光標識された相補オリゴヌクレオチドは合成されたDNAに結合し、これらのタンパク質相互作用を従来の蛍光顕微鏡で可視化することを可能にする。
ここで説明するプロトコルは、プラを使用して、科学者がアテロプロテク保護およびアテローム化SS条件で活性SMAD転写複合体の数を定量的に比較することを可能 に する。SSは定義されたレベルの層の単方向流れを生成し、流量の段階的な増加を可能にすることができるプログラム可能な空気ポンプシステムを介して生成される。この方法により、SMAD1/5またはSMAD2/3とSMAD4との相互作用、および混合R-SMAD複合体の相互作用を検出することができます。転写共調整因子とのSMADの相互作用を分析したり、SMAD以外の転写因子複合体に分析したりすることが容易に可能です。 図 1 は、以下に示すプロトコルの主要な手順を示しています。
図1:記載されたプロトコルの概略表現。 (A)6チャンネルスライドに播種された細胞は、空気圧ポンプシステムでせん断応力にさらされます。(B) 固定細胞はPLA実験や制御条件に使用されます。(C) PLA実験の画像は蛍光顕微鏡で取得し、ImageJ解析ソフトを用いて解析します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するPLAベースのプロトコルは、定量的および空間的解像度でせん断応力にさらされたECにおける2つのタンパク質の近接性(例えば、その直接相互作用)を効率的に決定する方法を提供します。複数の並列チャネルを有するフロースライドを使用することにより、複数の異なるタンパク質相互作用を同一の機械的条件下で細胞内で同時に検査することができます。対照的に、カスタム?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
マリア・ライヒェンバッハ博士とクリスチャン・ヒエペン博士がフローセットアップシステムをサポートし、エレノア・フォックスとユンユン・シャオが原稿を批判的に読んでくれて感謝します。P-L.Mは、国際的なマックスプランク研究学校IMPRS生物学と計算(IMPRS-BAC)によって資金提供されました。PKはDFG-SFB1444から資金提供を受けた。図 1 は、バイオレンダリングを使用して作成されました。
Materials
| µ-Slide VI 0.4 | ibidi | 80606 | 6-channel slide |
| Ammonium Chloride | Carl Roth | K298.1 | Quenching |
| Bovine Serum Albumin | Carl Roth | 8076.4 | Blocking |
| DAPI | Sigma Aldrich/ Merck | D9542 | Stain DNA/Nuclei |
| DPBS | PAN Biotech | P04-53500 | PBS |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92014 | PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides) |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92004 | MINUS probe |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92002 | PLUS probe |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma Aldrich/ Merck | DUO82049 | PLA wash buffers A and B |
| Endothelial Cell Growth Supplement | Corning | supplement for medium (ECGS) | |
| Fetal calf Serum | supplement for medium | ||
| FIJI | Image Analysis software | ||
| Formaldehyde solution 4% buffered | KLINIPATH/VWR | VWRK4186.BO1 | PFA |
| Full medium | M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu + 25 µg/mL Hep + 50 µg/mL ECGS | ||
| Gelatin from porcine skin, Type A | Sigma Aldrich | G2500 | Use 0.1% in PBS for coating of flow channels |
| GraphPad Prism v.7 | GarphPad | Statistical Program used for the Plots and statistical calculations | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H4784-250MG | supplement for medium (Hep) |
| HUVECs | |||
| ibidi Mounting Medium | ibidi | 50001 | Liquid mounting medium |
| ibidi Pump System | ibidi | 10902 | pneumatic pump |
| Leica TCS SP8 | Leica | confocal microscope | |
| L-Glutamin 200mM | PAN Biotech | P04-80100 | supplement for medium (L-Glu) |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | Base medium |
| mouse anti- SMAD1 Antibody | Abcam | ab53745 | Suited for PLA |
| mouse anti- SMAD2/3 Antibody | BD Bioscience | 610843 | Not suited for PLA in combination with CST 9515 |
| mousee anti- SMAD4 Antibody | Sanata Cruz Biotechnology | sc-7966 | Suited for PLA |
| Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml | PAN Biotech | P06-07100 | supplement for medium (P/S) |
| Perfusion Set WHITE | ibidi | 10963 | Tubings used for 1 dyn/cm2 |
| Perfusion Set YELLOW and GREEN | ibidi | 10964 | Tubings used for 30 dyn/cm2 |
| rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9516 | Suited for PLA |
| rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody | Cell Signaling Technologies | 8685 | Suited for PLA |
| rabbit anti- SMAD4 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9515 | Not suited for PLA in combination with BD 610843 |
| Serial Connector for µ-Slides | ibidi | 10830 | serial connection tubes |
| Triton X-100 | Carl Roth | 6683.1 | Permeabilization |
References
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