Summary

Extraction et purification de la protéine FAHD1 du rein de porc et du foie de souris

Published: February 18, 2022
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Summary

Ce protocole décrit comment extraire la protéine 1 contenant le domaine de l’hydrolase fumarylacétoacétate (FAHD1) du rein et du foie de souris. Les méthodes énumérées peuvent être adaptées à d’autres protéines d’intérêt et modifiées pour d’autres tissus.

Abstract

La protéine 1 contenant le domaine de l’hydrolase fumarylacétoacétate (FAHD1) est le premier membre identifié de la superfamille FAH chez les eucaryotes, agissant comme oxaloacétate décarboxylase dans les mitochondries. Cet article présente une série de méthodes pour l’extraction et la purification de FAHD1 à partir de reins de porcs et de foies de souris. Les méthodes couvertes sont la chromatographie par échange ionique avec chromatographie liquide à protéines rapides (FPLC), la filtration sur gel préparatif et analytique avec FPLC et les approches protéomiques. Après l’extraction des protéines totales, la précipitation du sulfate d’ammonium et la chromatographie par échange ionique ont été explorées, et FAHD1 a été extrait via une stratégie séquentielle utilisant la chromatographie par échange ionique et par exclusion de taille. Cette approche représentative peut être adaptée à d’autres protéines d’intérêt (exprimées à des niveaux significatifs) et modifiée pour d’autres tissus. Les protéines purifiées des tissus peuvent favoriser le développement d’anticorps de haute qualité et/ou d’inhibiteurs pharmacologiques puissants et spécifiques.

Introduction

La protéine 1 eucaryote contenant le domaine FAH (FAHD1) agit sous forme d’oxaloacétate bifonctionnel (OAA), decarboxylase (ODx)1 et d’hydrolase acylpyruvate (ApH)2. Il est localisé dans les mitochondries2 et appartient à la vaste superfamille faH des enzymes 1,2,3,4,5,6. Bien que son activité ApH ne soit que d’une pertinence mineure, l’activité ODx de FAHD1 est impliquée dans la régulation du flux de cycle TCA 1,7,8,9. L’OAA est non seulement nécessaire pour la réaction centrale de la citrate synthase dans le cycle de l’acide tricarboxylique, mais agit également comme un inhibiteur compétitif de la succinate déshydrogénase dans le cadre du système de transport d’électrons et comme métabolite cataplérotique. La régulation négative de l’expression du gène FAHD1 dans les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) a entraîné une réduction significative du taux de prolifération cellulaire10 et une inhibition significative du potentiel de la membrane mitochondriale, associée à un passage concomitant à la glycolyse. Le modèle de travail fait référence à la sénescence associée au dysfonctionnement mitochondrial (MiDAS)phénotype 8 de type MiDAS,11, où les niveaux d’OAA mitochondrial sont étroitement régulés par l’activité FAHD1 1,8,9.

La protéine recombinante est plus facile à obtenir par l’expression et la purification à partir de bactéries12 plutôt que de tissus. Cependant, une protéine exprimée dans les bactéries peut être biaisée par l’absence possible de modifications post-traductionnelles, ou peut simplement être problématique (c.-à-d. en raison de la perte de plasmides, des réponses au stress bactérien, des liaisons disulfures déformées / non formées, de l’absence ou d’une mauvaise sécrétion, de l’agrégation des protéines, du clivage protéolytique, etc.). Pour certaines applications, la protéine doit être obtenue à partir de lysat cellulaire ou de tissu, afin d’inclure de telles modifications et/ou d’exclure d’éventuels artefacts. Les protéines purifiées des tissus favorisent le développement d’anticorps de haute qualité et/ou d’inhibiteurs pharmacologiques puissants et spécifiques pour certaines enzymes, comme pour FAHD113.

Ce manuscrit présente une série de méthodes pour l’extraction et la purification de FAHD1 à partir de reins de porcs et de foies de souris. Les méthodes décrites nécessitent une chromatographie liquide à protéines rapides (FPLC), mais utilisent autrement un équipement de laboratoire commun. D’autres méthodes peuvent être trouvées ailleurs 14,15,16,17. Après l’extraction des protéines totales, le protocole proposé comprend une phase d’essai, au cours de laquelle les sous-protocoles de précipitation du sulfate d’ammonium et de chromatographie par échange ionique sont discutés (figure 1). Après avoir défini ces sous-protocoles, la protéine d’intérêt est extraite via une stratégie séquentielle utilisant l’échange ionique et la chromatographie d’exclusion de taille avec FPLC. Sur la base de ces lignes directrices, le protocole final peut être adapté individuellement à d’autres protéines d’intérêt.

Figure 1
Figure 1 : La stratégie globale de ce protocole. De haut en bas : Les protéines sont extraites des tissus. L’homogénat tissulaire est préparé, centrifugé et filtré. Pour chaque paire d’échantillons surnageants et d’échantillons dérivés de granulés, des tests de précipitation de sulfate d’ammonium et de chromatographie par échange ionique (FPLC) doivent être effectués pour sonder les conditions optimales. Après avoir établi ces sous-protocoles, la protéine peut être extraite par une procédure séquentielle de précipitation du sulfate d’ammonium, de chromatographie par échange ionique et de chromatographie d’exclusion de taille répétitive (FPLC) à des concentrations variables de pH et de sel. Toutes les étapes doivent être contrôlées par transfert western. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles. Le rein de porc a été obtenu frais du supermarché local. Des tissus hépatiques ont été prélevés sur des souris de type sauvage C57BL6 conservées à l’Institut de recherche biomédicale sur le vieillissement de l’Université d’Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Autriche, sous la supervision de l’Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr, couvert par l’autorisation éthique en tant que chef de projet délivrée en …

Representative Results

La protéine FAHD1 a été extraite du rein du porc et du foie de souris à l’aide du protocole présenté. Pour les tissus de souris, plusieurs organes sont nécessaires pour obtenir plusieurs μg après l’étape finale de purification. Pour cette raison, cet article se concentre sur l’extraction de FAHD1 à partir de reins de porcs, ce qui est une expérience beaucoup plus exemplaire. L’extraction de FAHD1 du foie de souris est effectuée pour présenter les difficultés et les pièges possibles de ce protocole…

Discussion

Étapes critiques du protocole
Il est essentiel de suivre les directives communes pour la manipulation des protéines, comme le travail sur la glace et à des conditions de pH et de sel modérées. L’utilisation d’inhibiteurs de la protéase est bénéfique pour la méthode, tandis que l’utilisation d’inhibiteurs du protéasome est fortement recommandée. La congélation et la décongélation de l’échantillon peuvent toujours entraîner une précipitation protéique (au moins partielle), de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs sont très reconnaissants de l’assistance technique d’Ayse Öztürk et Eva Albertini. Les souris utilisées pour la génération de tissu hépatique ont été maintenues sous la supervision de Univ.-Doz. Dr Pidder Jansen-Dürr (Institut de recherche biomédicale sur le vieillissement de l’Université d’Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Autriche).

Materials

0.22 µm filter units MERCK SLGP033RS Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril
0.45 µm filter units MERCK SLHP033NS Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril
15 mL Falcon tubes VWR 734-0451 centrifugal tubes
50 mL Falcon tubes VWR 734-0448 centrifugal tubes
96-Well UV Microplate Thermo-Fischer 8404 UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates
Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) BIO-RAD #1610147 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels
ÄKTA FPLC system GE Healthcare Life Sciences / Cytiva using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC901024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL
Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC801024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL
Ammonium sulfate powder MERCK A4418 ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0%
Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% MERCK 215589 Catalyst for acrylamide gel polymerization.
Coomassie Brilliant blue R 250 MERCK 1125530025 Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C)
Dialysis tubing cellulose membrane MERCK D9277 Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.
Eppendof tubes 1.5 mL VWR 525-1042 microcentrifugal tubes; autoclaved
HiLoad 26/600 Superdex 75 pg GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 28989334 HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins
Immun-Blot PVDF Membrane BIO-RAD #1620177 PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell BIO-RAD #1703930 Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels BIO-RAD #1658004 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.
Mono Q 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516701 Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.
Mono S 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516901 Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo-Fischer 26616 A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo-Fischer 23225 A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.
Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter Branson New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf
Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) Agilent Dako P0399 The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.
TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA MERCK T9281 TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.
Tube Roller A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71
Tube Rotator A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123
ULTRA-TURRAX; T 25 digital IKA 0003725000 New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/

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Cite This Article
Andric, A., Wagner, E., Heberle, A., Holzknecht, M., Weiss, A. K. H. Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver. J. Vis. Exp. (180), e63333, doi:10.3791/63333 (2022).

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