Adipócitos diferenciados de camundongos em cultura primária: um modelo de resistência à insulina

Summary

Este protocolo descreve o isolamento de pré-adipócitos de camundongos da gordura subcutânea, sua diferenciação em adipócitos maduros e a indução de resistência à insulina. A ação da insulina é avaliada pela fosforilação/ativação de membros da via de sinalização da insulina através do western blot. Este método permite a determinação direta da resistência/sensibilidade à insulina em adipócitos primários.

Abstract

A resistência à insulina é um efeito reduzido da insulina sobre suas células-alvo, geralmente derivado da diminuição da sinalização dos receptores de insulina. A resistência à insulina contribui para o desenvolvimento de diabetes tipo 2 (DM2) e outras doenças derivadas da obesidade de alta prevalência em todo o mundo. Portanto, a compreensão dos mecanismos subjacentes à resistência à insulina é de grande relevância. Vários modelos têm sido utilizados para estudar a resistência à insulina tanto in vivo quanto in vitro; Os adipócitos primários representam uma opção atraente para estudar os mecanismos de resistência à insulina e identificar moléculas que neutralizam essa condição e os alvos moleculares de drogas sensibilizadoras de insulina. Neste trabalho, estabelecemos um modelo de resistência insulínica utilizando adipócitos primários em cultura tratada com fator de necrose tumoral α (TNF-α).

As células precursoras de adipócitos (APCs), isoladas do tecido adiposo subcutâneo de camundongos digerido pela colagenase por tecnologia de separação magnética celular, são diferenciadas em adipócitos primários. A resistência à insulina é então induzida pelo tratamento com TNF-α, uma citocina pró-inflamatória que reduz a fosforilação/ativação da tirosina dos membros da cascata de sinalização da insulina. A diminuição da fosforilação do receptor de insulina (IR), substrato do receptor de insulina (IRS-1) e proteína quinase B (AKT) são quantificados por western blot. Este método fornece uma excelente ferramenta para estudar os mecanismos mediadores da resistência à insulina no tecido adiposo.

Introduction

A insulina é um hormônio anabólico produzido pelas células β das ilhotas pancreáticas e o principal regulador do metabolismo da glicose e dos lipídios. Dentre suas diversas funções, a insulina regula a captação de glicose, a síntese de glicogênio, a gliconeogênese, a síntese proteica, a lipogênese e a lipólise¹. O sinal molecular inicial após a interação da insulina com seu receptor (IR) é a ativação da atividade intrínseca da tirosina proteína quinase do IR², resultando em sua autofosforilação³ e na subsequente ativação de uma família de proteínas conhecidas como substratos do receptor de insulina (IRS), que se liga a proteínas adaptadoras levando à ativação de uma cascata de proteínas quinases⁴ . A insulina ativa duas vias principais de sinalização: fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)-proteína quinase B (AKT) e proteína quinase ativada por mitógeno Ras (MAPK). O primeiro constitui um importante ponto de ramificação ou nó ^4,5 para a ativação de numerosos efetores a jusante envolvidos em diversas funções fisiológicas, incluindo a regulação da homeostase do combustível, enquanto o segundo regula o crescimento e diferenciação celular ^4,6. As ações da insulina dependem, em última instância, do tipo celular e do contexto fisiológico⁷.

Um dos principais tecidos metabólicos responsivos à insulina é o tecido adiposo. O tecido adiposo branco é o tipo de gordura mais abundante em humanos e roedores, distribuído na gordura subcutânea (entre a pele e os músculos) e na gordura visceral (ao redor dos órgãos da cavidade abdominal). Dado o seu grande volume, os adipócitos ou células adiposas são o tipo celular mais abundante no tecido adiposo. Essas células adiposas podem ser marrons/beges (termogênicas), róseas (na glândula mamária) e^{brancas 8,9}. Os adipócitos brancos mantêm as principais reservas energéticas do organismo na forma de triglicerídeos, um processo insulino-dependente. A insulina promove o transporte de glicose e a lipogênese, ao mesmo tempo em que inibe a lipólise ou a degradação lipídica ^7,10. Também facilita a diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos — as células maduras que armazenam gordura¹¹.

A resistência à insulina ocorre quando um nível normal de insulina produz uma resposta biológica atenuada, resultando em hiperinsulinemia compensatória¹². A resistência à insulina é uma condição associada ao sobrepeso e à^obesidade5, que quando combinada leva ao diabetes tipo 2 (DM2) e outras doenças metabólicas¹³. A hiperinsulinemia compensa a resistência à insulina nos tecidos periféricos para manter os níveis glicêmicos normais¹⁴. No entanto, eventual perda ou exaustão de células β, juntamente com resistência insulínica exacerbada, leva a níveis elevados de glicose no sangue consistentes com DT25. Portanto, a resistência insulínica e a hiperinsulinemia podem contribuir para o desenvolvimento de doenças metabólicas derivadas da obesidade¹⁵. Além disso, a obesidade pode causar inflamação local crônica de baixo grau, promovendo resistência à insulina no tecido adiposo^15,16,17. Além disso, alterações no tecido adiposo derivadas da obesidade, como fibrose, inflamação e redução da angiogênese e adipogênese, levam a níveis séricos mais baixos de adiponectina (um sensibilizador de insulina) e aumento da secreção de fatores como inibidor do ativador do plasminogênio 1 (PAI-1), ácidos graxos livres e exossomos na corrente sanguínea, exacerbando a resistência à insulina¹⁷.

Muitos aspectos subjacentes à resistência à insulina permanecem desconhecidos. Modelos in vitro e in vivo têm sido desenvolvidos para estudar os mecanismos mediadores da resistência à insulina nos principais tecidos-alvo, incluindo o tecido adiposo. A vantagem dos modelos in vitro é que os pesquisadores têm maior controle das condições ambientais e podem avaliar a resistência à insulina em tipos celulares específicos. Particularmente, as células precursoras de adipócitos (APCs) têm o fenótipo individual do tecido doador, o que pode refletir melhor a fisiologia do que as linhagens celulares de adipócitos. Um dos principais fatores indutores de resistência à insulina in vitro é o fator de necrose tumoral-α (TNF-α). O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória secretada por adipócitos e macrófagos no tecido adiposo¹⁸. Embora seja necessária para o adequado remodelamento e expansão do tecido adiposo¹⁹, a exposição prolongada ao TNF-α induz resistência à insulina no tecido adiposo in vivo e nos adipócitos in vitro²⁰. O tratamento crônico com TNF-α de vários tipos celulares leva ao aumento da fosforilação da serina, tanto do IR quanto do IRS-1, promovendo assim a diminuição da fosforilação da tirosina²¹. O aumento da fosforilação da IRS-1 sobre resíduos de serina inibe a atividade da tirosina quinase IR e pode ser um dos principais mecanismos pelos quais o tratamento crônico do TNF-α prejudica a ação da insulina^22,23. O TNF-α ativa vias envolvendo o inibidor de serina/treonina quinase do fator nuclear ĸB quinase β (IKKβ) e c-Jun N quinase terminal (JNK)²⁴. JNK induz um complexo programa transcricional pró-inflamatório, mas também fosforila diretamente IRS-1⁶.

A compreensão da patogênese da resistência à insulina tem se tornado cada vez mais importante para orientar o desenvolvimento de futuras terapias contra a DM2. As VPAs têm se mostrado um excelente modelo para o estudo da biologia das células adiposas, incluindo a sensibilidade e resistência à insulina, e para a identificação das propriedades intrínsecas dos adipócitos independente do ambiente sistêmico. As APCs podem ser facilmente obtidas de diferentes depósitos adiposos e, sob condições apropriadas, diferenciadas em adipócitos maduros. Com esse método, efeitos diretos sobre a resistência/sensibilidade à insulina podem ser avaliados em adipócitos.

Protocol

Todos os experimentos com roedores foram aprovados pelo Comitê de Bioética do Instituto de Neurobiologia da UNAM, protocolo número 075. 1. Isolamento de células precursoras de adipócitos de camundongos Eutanásia de camundongos C57BL/6 machos de 8-10 semanas de idade (por exemplo, por inalação de CO2 e subsequente deslocamento cervical) (quatro animais por isolamento). Desinfetar os camundongos esfregando com etanol 70% e obter o tecido adiposo imed…

Representative Results

Nos últimos anos, o aumento da prevalência de obesidade e DM2 tem motivado uma intensa busca pelos mecanismos mediadores da resistência à insulina no tecido adiposo. Com o protocolo aqui descrito, as VPAs podem ser diferenciadas em adipócitos maduros para avaliar a resistência e a sensibilidade à insulina. Uma vez que as VPAs atingem a confluência, são necessários 10 dias para completar sua diferenciação em adipócitos maduros e sua indução de resistência à insulina mediada pelo TNF-α (<strong class="xfi…

Discussion

Este trabalho fornece um método para estudar a resistência à insulina que utiliza adipócitos primários em cultura tratada com TNF-α. Esse modelo tem a vantagem de que adipócitos primários podem ser cultivados em condições definidas por longos períodos de tempo com um controle rigoroso dos fatores ambientais celulares²⁶. A duração do ensaio é de 15-20 dias, embora variações na porcentagem de adipócitos diferenciados possam ocorrer entre os experimentos. Os adipócitos primários ap…

Materials

1. Isolation mouse adipocyte precursor cells
ACK lysing buffer	LONZA	10-548E
Anti-Biotin Microbeads	Miltenyi	130-090-485
Anti-CD31	eBioscience	13-0311-85
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi
Basement membrane matrix (matrigel)	Corning	354234
bFGF	Sigma	F0291	Growth factor
BSA	Equitech-Bio, Inc.	BAC63-1000
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) – Biotin	eBioscience	13-0451-85
Collagenase, Type 1	Worthington Biochem	LS004197
Dexamethasone	Sigma	D1756
DMEM	GIBCO	12800017
DMEM low glucose	GIBCO	31600-034
EGF	Peprotech	315-09	Growth factor
FBS	GIBCO	26140-079
ITS mix	Sigma	I3146
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960
LIF	Millipore	ESG1107	Growth factor
Linoleic acid-albumin	Sigma	L9530
MCDB 201 medium	Sigma	M6770
Normocin	InvivoGen	ant-nr-2
PDGF-BB	Peprotech	315-18	Growth factor
Peniciline-Streptomycine	BioWest	L0022-100
Pre-Separation Filters (70 µm)	Miltenyi	130-095-823
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32	BD Pharmingen	553142
Trypsin-EDTA	GIBCO	25300062
2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]	Sigma	I5879	Differentiation cocktail
BMP4	R&D Systems	5020-BP-010	Differentiation cocktail
Dexamethasone	Sigma	D1756	Differentiation cocktail
Insulin	Sigma	I9278
Rosiglitazone	Cayman	71742	Differentiation cocktail
TNFα	R&D Systems	210-TA-005
3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot
Anti-beta tubulin antibody	Abcam	ab6046
Bromophenol blue	BioRad	161-0404	Laemmli buffer
EDTA	Sigma	E5134	RIPA buffer
EGTA	Sigma	E4378	RIPA buffer
FluorChem E system	ProteinSimple
Glycerol	Sigma	G6279	Laemmli buffer
Glycine	Sigma	G7126	Running and Transfer buffer
Igepal	Sigma	I3021	RIPA buffer
2- mercaptoethanol	Sigma	M3148	Laemmli buffer
Methanol	JT Baker	907007	Transfer buffer
NaCl	JT Baker	3624-05	TBS-T
NaF	Sigma	77F-0379	RIPA buffer
NaOH	JT Baker	3722-19
Na4P2O7	Sigma	114F-0762	RIPA buffer
Na3VO4	Sigma	S6508	RIPA buffer
Nitrocellulose membrane	BioRad	1620112
Nonfat dry milk	BioRad	1706404	Blocking solution
Prestained protein standard	BioRad	1610395
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-132
Phospho- Insulin Receptor β	Cell signaling	3024
Phospho-Akt (Ser473) Antibody	Cell signaling	9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody	Millipore	9432
Saccharose	JT Baker	407205	RIPA buffer
SDS	BioRad	1610302	Running and laemmli buffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34577
Tris-base	Promega	H5135	Running, transfer and laemmli buffer
Tris-HCl	JT Baker	4103-02	RIPA buffer – TBS
Tween 20	Sigma	P1379	TBS-T