Дифференцированные адипоциты мышей в первичной культуре: модель инсулинорезистентности

Summary

Этот протокол описывает выделение преадипоцитов мыши из подкожно-жировой клетчатки, их дифференцировку в зрелые адипоциты и индукцию резистентности к инсулину. Действие инсулина оценивается по фосфорилированию/активации членов сигнального пути инсулина через вестерн-блоттинг. Этот метод позволяет напрямую определять резистентность/чувствительность к инсулину в первичных адипоцитах.

Abstract

Резистентность к инсулину – это сниженное влияние инсулина на клетки-мишени, обычно возникающее из-за снижения передачи сигналов рецептора инсулина. Инсулинорезистентность способствует развитию диабета 2 типа (СД2) и других заболеваний, связанных с ожирением, которые широко распространены во всем мире. Поэтому понимание механизмов, лежащих в основе резистентности к инсулину, имеет большое значение. Несколько моделей были использованы для изучения резистентности к инсулину как in vivo, так и in vitro; Первичные адипоциты представляют собой привлекательный вариант для изучения механизмов инсулинорезистентности и идентификации молекул, которые противодействуют этому состоянию, и молекулярных мишеней инсулин-сенсибилизирующих препаратов. Здесь мы создали модель резистентности к инсулину с использованием первичных адипоцитов в культуре, обработанной фактором некроза опухоли-α (TNF-α).

Клетки-предшественники адипоцитов (APC), выделенные из подкожной жировой ткани мыши, переваренной коллагеназой, с помощью технологии магнитного разделения клеток, дифференцируются в первичные адипоциты. Резистентность к инсулину затем индуцируется лечением TNF-α, провоспалительным цитокином, который снижает фосфорилирование/активацию тирозина членов сигнального каскада инсулина. Снижение фосфорилирования рецептора инсулина (IR), субстрата рецептора инсулина (IRS-1) и протеинкиназы B (AKT) количественно определяется вестерн-блоттингом. Этот метод является отличным инструментом для изучения механизмов, опосредующих резистентность к инсулину в жировой ткани.

Introduction

Инсулин является анаболическим гормоном, вырабатываемым островковыми β клетками поджелудочной железы, и ключевым регулятором метаболизма глюкозы и липидов. Среди своих многочисленных функций инсулин регулирует поглощение глюкозы, синтез гликогена, глюконеогенез, синтез белка, липогенез и липолиз¹. Начальным молекулярным сигналом после взаимодействия инсулина с его рецептором (IR) является активация внутренней активности тирозинпротеинкиназы IR², что приводит к его аутофосфорилированию³ и последующей активации семейства белков, известных как субстраты рецепторов инсулина (IRS), которое связывается с адапторными белками, что приводит к активации каскада протеинкиназ⁴ . Инсулин активирует два основных сигнальных пути: фосфатидилинозитол-3-киназу (PI3K)-протеинкиназу B (AKT) и Ras-митоген-активируемую протеинкиназу (MAPK). Первый представляет собой основную точку ветвления или узел ^4,5 для активации многочисленных нижестоящих эффекторов, участвующих в различных физиологических функциях, включая регуляцию топливного гомеостаза, тогда как второй регулирует рост и дифференцировку клеток ^4,6. Действие инсулина в конечном итоге зависит от типа клеток и физиологического контекста⁷.

Одной из основных чувствительных к инсулину метаболических тканей является жировая ткань. Белая жировая ткань является наиболее распространенным типом жира у людей и грызунов, распределенным в подкожном жире (между кожей и мышцами) и висцеральном жире (вокруг органов в брюшной полости). Учитывая их большой объем, адипоциты или жировые клетки являются наиболее распространенным типом клеток в жировой ткани. Эти жировые клетки могут быть коричневыми/бежевыми (термогенными), розовыми (в молочной железе) и белыми ^8,9. Белые адипоциты сохраняют основные запасы энергии в организме в виде триглицеридов, инсулинозависимого процесса. Инсулин способствует транспорту глюкозы и липогенезу, в то время как он ингибирует липолиз или расщепление липидов ^7,10. Он также облегчает дифференцировку преадипоцитов в адипоциты — зрелые жирозапасающие клетки¹¹.

Резистентность к инсулину возникает, когда нормальный уровень инсулина вызывает ослабленную биологическую реакцию, что приводит к компенсаторной гиперинсулинемии¹². Инсулинорезистентность — это состояние, связанное с избыточным весом и^{ожирением5}, которое в сочетании приводит к диабету 2 типа (СД2) и другим метаболическим заболеваниям¹³. Гиперинсулинемия компенсирует резистентность к инсулину в периферических тканях для поддержания нормального уровня глюкозы в крови¹⁴. Однако возможная потеря или истощение β-клеток вместе с обострением резистентности к инсулину приводит к повышению уровня глюкозы в крови, соответствующего^{СД2 5}. Таким образом, инсулинорезистентность и гиперинсулинемия могут способствовать развитию метаболических заболеваний, связанных с ожирением¹⁵. Кроме того, ожирение может вызывать хроническое местное воспаление низкой степени, способствующее резистентности к инсулину в жировой ткани^15,16,17. Кроме того, изменения в жировой ткани, вызванные ожирением, такие как фиброз, воспаление и снижение ангиогенеза и адипогенеза, приводят к снижению уровня адипонектина в сыворотке крови (сенсибилизатора инсулина) и повышенной секреции таких факторов, как ингибитор активатора плазминогена 1 (PAI-1), свободные жирные кислоты и экзосомы в кровоток, усугубляя резистентность к инсулину¹⁷.

Многие аспекты, лежащие в основе резистентности к инсулину, остаются неизвестными. Были разработаны модели in vitro и in vivo для изучения механизмов, опосредующих резистентность к инсулину в основных тканях-мишенях, включая жировую ткань. Преимущество моделей in vitro заключается в том, что исследователи лучше контролируют условия окружающей среды и могут оценить резистентность к инсулину в определенных типах клеток. В частности, клетки-предшественники адипоцитов (APC) имеют индивидуальный фенотип донорской ткани, который может отражать физиологию лучше, чем клеточные линии адипоцитов. Основным фактором, индуцирующим резистентность к инсулину in vitro, является фактор некроза опухоли-α (TNF-α). TNF-α представляет собой провоспалительный цитокин, секретируемый адипоцитами и макрофагами в жировой ткани¹⁸. Несмотря на то, что он необходим для правильного ремоделирования и расширения жировой ткани¹⁹, длительное воздействие ФНО-α вызывает резистентность к инсулину в жировой ткани in vivo и в адипоцитах in vitro²⁰. Хроническое лечение TNF-α нескольких типов клеток приводит к увеличению фосфорилирования серина как IR, так и IRS-1, тем самым способствуя снижению фосфорилирования тирозина²¹. Повышенное фосфорилирование IRS-1 на остатках серина ингибирует активность IR-тирозинкиназы и может быть одним из ключевых механизмов, с помощью которых лечение хроническим TNF-α ухудшает действие инсулина^22,23. TNF-α активирует пути с участием ингибитора серин/треонинкиназы ядерного фактора ĸB киназы β (IKKβ) и концевой киназы c-Jun N (JNK)²⁴. JNK индуцирует сложную провоспалительную транскрипционную программу, но также непосредственно фосфорилирует IRS-1⁶.

Понимание патогенеза резистентности к инсулину становится все более важным для разработки будущих методов лечения СД2. APC оказались отличной моделью для изучения биологии жировых клеток, включая чувствительность и резистентность к инсулину, а также для выявления внутренних свойств адипоцитов независимо от системной среды. APC могут быть легко получены из различных жировых депо и при соответствующих условиях дифференцированы в зрелые адипоциты. С помощью этого метода можно оценить прямое влияние на резистентность/чувствительность к инсулину в адипоцитах.

Protocol

Все эксперименты на грызунах были одобрены Комитетом по биоэтике Института нейробиологии УНАМ, протокол No 075. 1. Выделение клеток-предшественников адипоцитов мыши Усыпить 8-10-недельных самцов мышей C57BL/6 (например, путем вдыхания CO2 и последующего вывих…

Representative Results

За последние несколько лет возросшая распространенность ожирения и СД2 вызвала интенсивный поиск механизмов, опосредующих резистентность к инсулину в жировой ткани. С помощью протокола, описанного здесь, APC могут быть дифференцированы на зрелые адипоциты для оценки резистентности и ч…

Discussion

В данной работе представлен метод изучения инсулинорезистентности, использующий первичные адипоциты в культуре, обработанной ФНО-α. Преимущество этой модели заключается в том, что первичные адипоциты можно культивировать в определенных условиях в течение длительных периодов времен?…

Materials

1. Isolation mouse adipocyte precursor cells
ACK lysing buffer	LONZA	10-548E
Anti-Biotin Microbeads	Miltenyi	130-090-485
Anti-CD31	eBioscience	13-0311-85
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi
Basement membrane matrix (matrigel)	Corning	354234
bFGF	Sigma	F0291	Growth factor
BSA	Equitech-Bio, Inc.	BAC63-1000
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) – Biotin	eBioscience	13-0451-85
Collagenase, Type 1	Worthington Biochem	LS004197
Dexamethasone	Sigma	D1756
DMEM	GIBCO	12800017
DMEM low glucose	GIBCO	31600-034
EGF	Peprotech	315-09	Growth factor
FBS	GIBCO	26140-079
ITS mix	Sigma	I3146
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960
LIF	Millipore	ESG1107	Growth factor
Linoleic acid-albumin	Sigma	L9530
MCDB 201 medium	Sigma	M6770
Normocin	InvivoGen	ant-nr-2
PDGF-BB	Peprotech	315-18	Growth factor
Peniciline-Streptomycine	BioWest	L0022-100
Pre-Separation Filters (70 µm)	Miltenyi	130-095-823
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32	BD Pharmingen	553142
Trypsin-EDTA	GIBCO	25300062
2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]	Sigma	I5879	Differentiation cocktail
BMP4	R&D Systems	5020-BP-010	Differentiation cocktail
Dexamethasone	Sigma	D1756	Differentiation cocktail
Insulin	Sigma	I9278
Rosiglitazone	Cayman	71742	Differentiation cocktail
TNFα	R&D Systems	210-TA-005
3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot
Anti-beta tubulin antibody	Abcam	ab6046
Bromophenol blue	BioRad	161-0404	Laemmli buffer
EDTA	Sigma	E5134	RIPA buffer
EGTA	Sigma	E4378	RIPA buffer
FluorChem E system	ProteinSimple
Glycerol	Sigma	G6279	Laemmli buffer
Glycine	Sigma	G7126	Running and Transfer buffer
Igepal	Sigma	I3021	RIPA buffer
2- mercaptoethanol	Sigma	M3148	Laemmli buffer
Methanol	JT Baker	907007	Transfer buffer
NaCl	JT Baker	3624-05	TBS-T
NaF	Sigma	77F-0379	RIPA buffer
NaOH	JT Baker	3722-19
Na4P2O7	Sigma	114F-0762	RIPA buffer
Na3VO4	Sigma	S6508	RIPA buffer
Nitrocellulose membrane	BioRad	1620112
Nonfat dry milk	BioRad	1706404	Blocking solution
Prestained protein standard	BioRad	1610395
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-132
Phospho- Insulin Receptor β	Cell signaling	3024
Phospho-Akt (Ser473) Antibody	Cell signaling	9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody	Millipore	9432
Saccharose	JT Baker	407205	RIPA buffer
SDS	BioRad	1610302	Running and laemmli buffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34577
Tris-base	Promega	H5135	Running, transfer and laemmli buffer
Tris-HCl	JT Baker	4103-02	RIPA buffer – TBS
Tween 20	Sigma	P1379	TBS-T