Summary

Malachit-Green-Assay zur Entdeckung von Hitzeschockprotein-90-Inhibitoren

Published: January 20, 2023
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Summary

Das Malachit-Green-Assay-Protokoll ist eine einfache und kostengünstige Methode zur Entdeckung von Hitzeschockprotein-90-Suppressoren (Hsp90) sowie anderer Hemmstoffe gegen ATP-abhängige Enzyme.

Abstract

Das Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) ist aufgrund seiner begleitenden Wirkung auf mehrere onkogene Proteine ein vielversprechendes Ziel gegen Krebs. Die Aktivität von Hsp90 hängt von seiner Fähigkeit ab, Adenosintriphosphat (ATP) zu Adenosindiphosphat (ADP) und freiem Phosphat zu hydrolysieren. Die ATPase-Aktivität von Hsp90 ist mit seiner Chaperoning-Funktion verbunden; ATP bindet an die N-terminale Domäne des Hsp90, und die Unterbrechung seiner Bindung erwies sich als die erfolgreichste Strategie zur Unterdrückung der Hsp90-Funktion. Die ATPase-Aktivität kann durch einen kolorimetrischen Malachit-Grün-Assay gemessen werden, der die Menge an freiem Phosphat bestimmt, das durch ATP-Hydrolyse gebildet wird. In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Bestimmung der ATPase-Aktivität der Hefe Hsp90 unter Verwendung des Malachit-Grünphosphat-Assay-Kits beschrieben. Darüber hinaus wird eine detaillierte Anleitung zur Entdeckung von Hsp90-Inhibitoren durch die Einnahme von Geldanamycin als authentischem Inhibitor bereitgestellt. Abschließend wird die Anwendung dieses Assay-Protokolls durch das Hochdurchsatz-Screening (HTS) von Inhibitormolekülen gegen Hefe Hsp90 diskutiert.

Introduction

Das Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) ist ein molekulares Chaperon, das die Stabilität von Proteinen aufrechterhält, die für die Entstehung und das Fortschreiten von Krebs verantwortlich sind. Darüber hinaus sind auch Proteine, die für die Entwicklung von Resistenzen gegen antineoplastische Wirkstoffe verantwortlich sind, Kunden von Hsp901. Hsp90 wird ubiquitär in allen Krebszelltypen (>90% der zellulären Proteine) überexprimiert, verglichen mit normalen Zellen, in denen es weniger als 2% der gesamten Proteine ausmachen kann. Darüber hinaus befindet sich das Hsp90 von Krebszellen in einem Komplex mit Co-Chaperonen, während es in einer normalen Zelle überwiegend in einem freien, nicht komplexierten Zustand vorliegt 2,3. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass mehrere Hsp90-Inhibitoren in In-vitro- und In-vivo-Studien senolytische Wirkungen besitzen, wobei sie die Lebensdauer von Mäusen signifikant verbessert haben 4,5,6. Alle oben genannten Ergebnisse untermauern die Tatsache, dass Hsp90-Inhibitoren bei mehreren Krebsarten wirksam sein könnten, mit weniger Nebenwirkungen und geringerem Risiko, Resistenzen zu entwickeln. Die Chaperoning-Funktion von Hsp90 wird durch die Bindung von ATP an der N-terminalen Domäne von Hsp90 und die Hydrolyse in ADP und freies Phosphat7 erreicht. Es wurde festgestellt, dass kleine Moleküle, die kompetitiv an die ATP-Bindungstasche von Hsp90 binden, den Chaperoning-Effekt des Proteins erfolgreich unterdrücken. Bis heute ist dies die beste Strategie zur Hemmung von Hsp90, was durch die Tatsache gestützt wird, dass solche Inhibitoren in die klinische Erprobung gelangt sind8. Eines davon, Pimitespib, wurde im Juni 2022 in Japan für die Behandlung von gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) zugelassen9. Dies ist der erste Hsp90-Inhibitor, der seit der Einführung der Behandelbarkeit des Chaperons im Jahr 1994 zugelassen wurde10.

Der Malachitgrün-Assay ist ein einfaches, empfindliches, schnelles und kostengünstiges Verfahren zum Nachweis von anorganischem Phosphat, das für die Automatisierung und das Hochdurchsatz-Screening (HTS) von Verbindungen gegen das gewünschte Zielgeeignet ist 11. Der Assay wurde erfolgreich für das Screening von Hsp90-Inhibitoren in kleinen Laboraufbauten sowie in einem HTS 12,13,14,15,16,17 eingesetzt. Der Assay verwendet eine kolorimetrische Methode, die das freie anorganische Phosphat bestimmt, das aufgrund der ATPase-Aktivität von Hsp90 gebildet wird. Grundlage dieser Quantifizierung ist die Bildung eines Phosphohomolybdat-Komplexes zwischen freiem Phosphat und Molybdän, der anschließend mit Malachitgrün zu einer grünen Farbe reagiert (Abbildung 1). Diese schnelle Farbbildung wird auf einem Spektralphotometer oder auf einem Plattenlesegerät zwischen 600-660 nm18,19 gemessen.

Im vorliegenden Protokoll wird das Verfahren zur Durchführung eines Malachitgrün-Assays mit Hefe Hsp90 und anschließender Identifizierung von Inhibitoren gegen das Chaperon beschrieben. Das Naturstoffmolekül Geldanamycin (GA), mit dem die Arzneibarkeit von Hsp90 erstmals nachgewiesen wurde, wurde als authentischer Inhibitor eingenommen10. HTS ist aufgrund der Verfügbarkeit einer großen Anzahl von Molekülen für Tests zu einem integralen Bestandteil des aktuellen Wirkstoffforschungsprogramms geworden. Diese Technik hat in den letzten 2 Jahren an Bedeutung gewonnen, da dringend Medikamente zur Behandlung von Covid-19-Infektionen umgewidmet werdenmüssen 20,21. Daher wird ein detaillierter Überblick über die HTS von Molekülen gegen Hefe-Hsp90-Protein unter Anwendung der Malachit-Green-Assay-Methode gegeben.

Protocol

1. Malachit-Grün-Assay im Labormaßstab Herstellung des Assay-PuffersBereiten Sie den Assay-Puffer gemäß der Zusammensetzung und Zubereitung in Tabelle 1 vor. Erstellung von PhosphatstandardsVerwenden Sie 1 mM Phosphatstandard, der im Malachitgrün-Assay-Phosphat-Assay-Kit enthalten ist (gelagert bei 4 °C). Pipettieren Sie 40 μl 1 mM Phosphatstandard in 960 μl Reinstwasser, um 40 μM Phosphatlösung (Vormischlösung) zu erh…

Representative Results

Die Ergebnisse des Assays werden in Bezug auf die Absorption aufgrund der Konzentration der freien Phosphationen interpretiert. Die Absorption durch freies Phosphat aufgrund der ATP-Hydrolyse durch die Hefe Hsp90 bei 620 nm wird als 100%ige ATPase-Aktivität oder nullprozentige Proteinhemmung angesehen. Die Hemmung des Proteins führt zum Aufhören der ATP-Hydrolyse (weniger freies Phosphat). Dies spiegelt sich in einer verringerten Absorption bei 620 nm wider. Ergebnisse des Malachit-…

Discussion

Hsp90 ist ein wichtiges Ziel für die Entdeckung neuartiger Moleküle gegen Krebsmedikamente. Seit der Etablierung der Arzneibarkeit im Jahr 1994 haben10.18 Moleküle klinische Studien erreicht. Derzeit befinden sich sieben Moleküle in verschiedenen Phasen der klinischen Erprobung, entweder allein oder in Kombination22. Alle diese kleinen Moleküle sind N-terminale ATP-bindende Inhibitoren. Die anderen Mittel zur Hemmung des Chaperons (C-terminale Inhibitoren, Middle-Domai…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde durch das Korea Research Fellowship (KRF) Programm, Postdoktorand der National Research Foundation of Korea (NRF), finanziert durch das Ministerium für Wissenschaft und IKT unterstützt (NRF-2019H1D3A1A01102952). Die Autoren danken dem KIST-Zuschuss und dem Zuschuss des Ministeriums für Ozeane und Fischerei mit der Nummer 2MRB130 für die finanzielle Unterstützung dieses Projekts.

Materials

1M Magnesium chloride solution in water Sigma-Aldrich 63069-100ml
1M Potassium chloride solution in water Sigma-Aldrich 60142-100ml
96-well plate SPL Life Sciences Not applicable
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A7699-5G
Biomek FX laboratory automation workstation Beckman Coulter Not applicable
Compounds 3-96 Not applicable Not applicable Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues.
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Geldanamycin, 99% (HPLC), powder AK Scientific, Inc. V2064
Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher Scientific 10977015
Malachite Green Phosphate Assay  Assay kit Sigma-Aldrich MAK307-1KT
Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT Biotek Instruments, Inc. Not applicable
Synergy HT multi-plate reader Biotek Instruments, Inc. Not applicable
Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 Sigma-Aldrich 93313-1L
Yeast Hsp90 Not applicable Not applicable School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829

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Gupta, S. D., Song, D., Lee, S., Lee, J. W., Park, J., Prodromou, C., Pan, C. Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors. J. Vis. Exp. (191), e64693, doi:10.3791/64693 (2023).

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