Isı şoku proteini 90 inhibitörlerinin keşfi için malakit yeşil testi
Summary
Malakit yeşil tahlil protokolü, ısı şoku proteini 90 (Hsp90) baskılayıcılarını ve ATP’ye bağımlı enzimlere karşı diğer inhibitör bileşikleri keşfetmek için basit ve uygun maliyetli bir yöntemdir.
Abstract
Isı şoku proteini 90 (Hsp90), çoklu onkojenik proteinler üzerindeki chaperoning etkisi nedeniyle umut verici bir antikanser hedefidir. Hsp90’ın aktivitesi, adenozin trifosfatı (ATP) adenozin difosfata (ADP) ve serbest fosfata hidrolize etme kabiliyetine bağlıdır. Hsp90’ın ATPaz aktivitesi chaperoning fonksiyonu ile bağlantılıdır; ATP, Hsp90’ın N-terminal alanına bağlanır ve bağlanmasını bozmanın Hsp90 fonksiyonunu bastırmada en başarılı strateji olduğu bulunmuştur. ATPaz aktivitesi, ATP hidrolizi tarafından oluşturulan serbest fosfat miktarını belirleyen kolorimetrik malakit yeşil testi ile ölçülebilir. Burada, malakit yeşil fosfat tahlil kiti kullanılarak maya Hsp90’ın ATPaz aktivitesini belirlemek için bir prosedür açıklanmaktadır. Ayrıca, gerçek bir inhibitör olarak geldanamisin alarak Hsp90 inhibitörlerinin keşfi için ayrıntılı talimatlar verilmiştir. Son olarak, bu tahlil protokolünün inhibitör moleküllerinin maya Hsp90’a karşı yüksek verimli taraması (HTS) yoluyla uygulanması tartışılmıştır.
Introduction
Isı şoku proteini 90 (Hsp90), kanserin gelişmesinden ve ilerlemesinden sorumlu proteinlerin stabilitesini koruyan moleküler bir şaperondur. Ek olarak, antineoplastik ajanlara karşı direnç gelişmesinden sorumlu proteinler de Hsp901’in müşterileridir. Hsp90, toplam proteinlerin% 2’sinden azını oluşturabileceği normal hücrelere kıyasla, tüm kanser hücresi tiplerinde (hücresel proteinlerin% >90’ı) her yerde aşırı eksprese edilir. Dahası, kanser hücrelerinin Hsp90’ı eş-şaperonlarla birlikte bir komplekste bulunurken, normal bir hücrede ağırlıklı olarak serbest, kompleks olmayan bir durumda bulunur 2,3. Son yıllarda, birkaç Hsp90 inhibitörünün in vitro ve in vivo çalışmalarda senolitik etkilere sahip olduğu gösterilmiştir ve burada farelerin ömrünü önemli ölçüde iyileştirmiştir 4,5,6. Yukarıda belirtilen tüm bulgular, Hsp90 inhibitörlerinin birden fazla kanser türünde, daha az yan etki ve daha az direnç geliştirme şansı ile etkili olabileceğini doğrulamaktadır. Hsp90’ın chaperoning fonksiyonu, ATP’yi Hsp90’ın N-terminal alanına bağlayarak ve ADP ve serbest fosfat7’ye hidrolize ederek gerçekleştirilir. Hsp90’ın ATP bağlanma cebine rekabetçi bir şekilde bağlanan küçük moleküllerin, proteinin chaperoning etkisini başarıyla bastırdığı bulundu. Bugüne kadar, bu, bu tür inhibitörlerin klinik çalışmalara ulaştığı gerçeğiyle desteklenen Hsp90 inhibisyonu için en iyi strateji olmaya devam etmektedir8. Bunlardan biri olan Pimitespib, Haziran 2022’de gastrointestinal stromal tümörün (GIST) tedavisi için Japonya’da onaylandı9. Bu, şaperonun uyuşturulabilirliğinin 1994 yılında kurulmasından bu yana onaylanan ilk Hsp90 inhibitörüdür10.
Malakit yeşil tahlili, inorganik fosfatın tespiti için basit, hassas, hızlı ve ucuz bir prosedürdür, istenen hedef11’e karşı bileşiklerin otomasyonu ve yüksek verimli taraması (HTS) için uygundur. Tahlil, küçük laboratuvar ölçekli kurulumlarda ve HTS 12,13,14,15,16,17’de Hsp90 inhibitörlerinin taranması için başarıyla kullanılmıştır. Tahlil, Hsp90’ın ATPaz aktivitesi nedeniyle oluşan serbest inorganik fosfatı belirleyen kolorimetrik bir yöntem kullanır. Bu nicelemenin temeli, serbest fosfat ve molibden arasında bir fosfomolibdat kompleksinin oluşmasıdır ve daha sonra yeşil bir renk oluşturmak için malakit yeşili ile reaksiyona girer (Şekil 1). Bu hızlı renk oluşumu bir spektrofotometrede veya bir plaka okuyucuda 600-660 nm18,19 arasında ölçülür.
Bu protokolde, maya Hsp90 ile malakit yeşil bir tahlil yapılması ve daha sonra şaperona karşı inhibitörlerin tanımlanması prosedürü açıklanmaktadır. Hsp90’ın uyuşturulabilirliğinin ilk kez kurulduğu doğal ürün molekülü geldanamisin (GA), otantik bir inhibitör10 olarak alınmıştır. HTS, test için çok sayıda molekülün mevcudiyeti nedeniyle mevcut ilaç keşif programının ayrılmaz bir parçası haline gelmiştir. Bu teknik, Covid-19 enfeksiyonunun tedavisi için ilaçların yeniden kullanılmasına acil ihtiyaç duyulması nedeniyle son 2 yılda daha fazla önem kazanmıştır20,21. Bu nedenle, moleküllerin HTS için maya Hsp90 proteinine karşı malakit yeşil tahlil yöntemi benimsenerek ayrıntılı bir taslak sunulmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hsp90, yeni antikanser ilaç moleküllerinin keşfi için önemli bir hedeftir. Uyuşturulabilirliğinin kurulduğu 1994 yılından bu yana10, 18 molekül klinik çalışmalara ulaşmıştır. Şu anda, yedi molekül tek başına veya kombinasyon halinde22 klinik çalışmaların çeşitli aşamalarındadır. Tüm bu küçük moleküller N-terminal ATP bağlanma inhibitörleridir. Şaperonu inhibe etmenin diğer yolları (C-terminal inhibitörleri, orta alan inhibitörleri)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Kore Ulusal Araştırma Vakfı’nın (NRF) doktora sonrası araştırmacısı olan Kore Araştırma Bursu (KRF) programı tarafından desteklenmiştir ve bilim ve BİT Bakanlığı (NRF-2019H1D3A1A01102952) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, bu projeye mali yardım sağladıkları için KIST intramural hibesine ve Okyanuslar ve Balıkçılık Bakanlığı hibe numarası 2MRB130’a müteşekkirdir.
Materials
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
References
- Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
- Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).
- Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
- Dutta Gupta, S., Pan, C. H. Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents. International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging. Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).
- Pearl, L. H., Prodromou, C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).
- Park, H. -. K., et al. Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1. Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).
- Hoy, S. M. Pimitespib: first approval. Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).
- Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).
- Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
- Sheikha, G. A., Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).
- Al-Sha’er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).
- Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).
- Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure. Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).
- Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors. Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).
- Dutta Gupta, S., et al. 2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead. Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).
- Feng, J., et al. An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application. Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).
- Gupta, S. D., et al. Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors. International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).
- Zhao, Y., et al. High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors. Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).
- Giri, A. K., Ianevski, A. High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers. Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).
- Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. Advanced Studies in Experimental and Clinical. , 107-122 (2021).
- Jaeger, A. M., Whitesell, L. HSP90: enabler of cancer adaptation. Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).
- Yang, S., Xiao, H., Cao, L. Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).
- Mishra, S. J., et al. The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).
- Khandelwal, A., et al. Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor. Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).
- Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells. ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).
- Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).
- Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases. Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747 (2021).
- Howes, R., et al. A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90. Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).
- Opalińska, M., Jańska, H. AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis. Cells. 7 (10), 163 (2018).
- Ambrose, A. J., Chapman, E. Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).
- Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity. Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).
