Малахитовый зеленый анализ для открытия ингибиторов белка теплового шока 90
Summary
Протокол анализа малахитового зеленого является простым и экономически эффективным методом обнаружения супрессоров белка теплового шока 90 (Hsp90), а также других соединений-ингибиторов против АТФ-зависимых ферментов.
Abstract
Белок теплового шока 90 (Hsp90) является многообещающей противоопухолевой мишенью из-за его сопровождающего действия на несколько онкогенных белков. Активность Hsp90 зависит от его способности гидролизовать аденозинтрифосфат (АТФ) до аденозиндифосфата (АДФ) и свободного фосфата. Активность АТФазы Hsp90 связана с ее сопровождающей функцией; АТФ связывается с N-концевым доменом Hsp90, и нарушение его связывания оказалось наиболее успешной стратегией подавления функции Hsp90. Активность АТФазы можно измерить с помощью колориметрического анализа малахитового зеленого, который определяет количество свободного фосфата, образующегося при гидролизе АТФ. Здесь описана процедура определения АТФазной активности дрожжей Hsp90 с использованием набора для анализа малахитового зеленого фосфата. Кроме того, приведены подробные инструкции по обнаружению ингибиторов Hsp90 путем приема гелданамицина в качестве аутентичного ингибитора. Наконец, обсуждается применение этого протокола анализа посредством высокопроизводительного скрининга (HTS) молекул ингибитора против дрожжей Hsp90.
Introduction
Белок теплового шока 90 (Hsp90) является молекулярным шапероном, который поддерживает стабильность белков, ответственных за развитие и прогрессирование рака. Кроме того, белки, ответственные за развитие резистентности к противоопухолевым средствам, также являются клиентами Hsp901. Hsp90 повсеместно экспрессируется во всех типах раковых клеток (>90% клеточных белков) по сравнению с нормальными клетками, где он может составлять менее 2% от общего количества белков. Более того, Hsp90 раковых клеток находится в комплексе с кошаперонами, тогда как в нормальной клетке он присутствует преимущественно в свободном, некомплексном состоянии 2,3. В последние годы было продемонстрировано, что несколько ингибиторов Hsp90 обладают сенолитическим действием в исследованиях in vitro и in vivo, где они значительно улучшили продолжительность жизни мышей 4,5,6. Все вышеупомянутые результаты подтверждают тот факт, что ингибиторы Hsp90 могут быть эффективными при нескольких типах рака, с меньшими побочными эффектами и сниженными шансами развития резистентности. Сопровождающая функция Hsp90 осуществляется путем связывания АТФ в N-концевом домене Hsp90 и гидролиза его в АДФ и свободный фосфат7. Было обнаружено, что небольшие молекулы, которые конкурентно связываются с АТФ-связывающим карманом Hsp90, успешно подавляют сопровождающий эффект белка. На сегодняшний день это остается лучшей стратегией ингибирования Hsp90, что подтверждается тем фактом, что такие ингибиторы дошли до клинических испытаний8. Один из них, Pimitespib, был одобрен в Японии для лечения гастроинтестинальной стромальной опухоли (GIST) в июне 2022года 9. Это первый ингибитор Hsp90, одобренный с тех пор, как в 1994 году была установлена лекарственная способность шаперона10.
Анализ малахитового зеленого представляет собой простую, чувствительную, быструю и недорогую процедуру обнаружения неорганического фосфата, подходящую для автоматизации и высокопроизводительного скрининга (HTS) соединений по желаемой цели11. Анализ был успешно использован для скрининга ингибиторов Hsp90 в небольших лабораторных установках, а также в HTS 12,13,14,15,16,17. В анализе используется колориметрический метод, который определяет свободный неорганический фосфат, образующийся из-за активности АТФазы Hsp90. Основой этого количественного определения является образование фосфомолибдатного комплекса между свободным фосфатом и молибденом, который впоследствии вступает в реакцию с малахитовым зеленым цветом с образованием зеленого цвета (рис. 1). Это быстрое формирование цвета измеряется на спектрофотометре или на планшетном считывателе в диапазоне 600-660 нм18,19.
В настоящем протоколе описана процедура проведения анализа малахитового зеленого с дрожжами Hsp90 и последующей идентификации ингибиторов против шаперона. Молекула натурального продукта, гелданамицин (GA), с помощью которой впервые была установлена лекарственная способность Hsp90, была принята в качестве подлинного ингибитора10. HTS стала неотъемлемой частью текущей программы открытия лекарств из-за наличия большого количества молекул для тестирования. Этот метод приобрел большее значение в последние 2 года из-за острой необходимости перепрофилирования лекарств для лечения инфекции Covid-1920,21. Таким образом, представлена подробная схема HTS молекул против белка дрожжей Hsp90 с использованием метода анализа малахитового зеленого.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hsp90 является важной мишенью для открытия новых противоопухолевых молекул лекарств. С тех пор, как в 1994 году была установлена его лекарственная пригодность,10 молекул достигли клинических испытаний. В настоящее время семь молекул находятся в различных фазах клинических исп?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано программой Korea Research Fellowship (KRF), постдокторантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемой Министерством науки и ИКТ (NRF-2019H1D3A1A01102952). Авторы выражают благодарность внутреннему гранту KIST и гранту Министерства океанов и рыболовства No 2MRB130 за оказание финансовой помощи для этого проекта.
Materials
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
References
- Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
- Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).
- Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
- Dutta Gupta, S., Pan, C. H. Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents. International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging. Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).
- Pearl, L. H., Prodromou, C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).
- Park, H. -. K., et al. Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1. Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).
- Hoy, S. M. Pimitespib: first approval. Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).
- Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).
- Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
- Sheikha, G. A., Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).
- Al-Sha’er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).
- Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).
- Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure. Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).
- Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors. Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).
- Dutta Gupta, S., et al. 2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead. Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).
- Feng, J., et al. An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application. Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).
- Gupta, S. D., et al. Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors. International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).
- Zhao, Y., et al. High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors. Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).
- Giri, A. K., Ianevski, A. High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers. Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).
- Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. Advanced Studies in Experimental and Clinical. , 107-122 (2021).
- Jaeger, A. M., Whitesell, L. HSP90: enabler of cancer adaptation. Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).
- Yang, S., Xiao, H., Cao, L. Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).
- Mishra, S. J., et al. The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).
- Khandelwal, A., et al. Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor. Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).
- Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells. ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).
- Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).
- Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases. Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747 (2021).
- Howes, R., et al. A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90. Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).
- Opalińska, M., Jańska, H. AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis. Cells. 7 (10), 163 (2018).
- Ambrose, A. J., Chapman, E. Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).
- Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity. Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).
